使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体制造技术

本发明专利技术提供了一种用于使用定点重组将核酸靶向整合到自主复制核酸上的新颖方法，所述方法允许使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体。

Loading more than one delivery vehicle in sequence using a single selectable marker

The present invention provides a novel method for integrating nucleic acid targeting onto self-replicating nucleic acid using site-directed recombination, which allows sequential loading of more than one delivery vector using a single selectable marker.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体相关申请的交叉引用本国际PCT专利申请要求于2016年4月12日提交的美国临时专利申请第62/321,711号的优先权。关于政府支持的声明本专利技术根据由DARPA授予的合同D15PC00008在政府支持下进行。政府在本专利技术中具有一定权利。专利
本专利技术涵盖用于使用定点重组递送到自主复制核酸上的靶向整合体的无药物选择的方法，所述方法允许使用单个可选择标志物顺序装载多于一个(multiple)递送载体。专利技术背景在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文所包含的任何内容不得被解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保持在适当的情况下证明本文引用的文章和方法根据可应用的法定条文无法构成现有技术的权利。生成全功能哺乳动物合成染色体的能力代表了用于以下的强大系统：基于细胞的遗传紊乱矫正、转基因动物中重组蛋白的产生、多种细胞类型以及人类疾病的动物模型中大的人类基因的调控和表达分析、减数分裂和染色体结构的研究、指导细胞分化和去分化、诱导的多能(pluripotent)干细胞的形成、创造新型自分泌和旁分泌细胞通信网络、创造能够进行多于一个编码的因子的化学计量的产生的多表达系统、生物电路的产生、能够探测核结构的DNA元件的插入和下游用于使用核结构中发现的相互作用调控基因组表达的用途，以及大的DNA元件的操作，诸如但不限于染色体臂交换到合成染色体上或将多于一个大的DNA元件掺入到合成染色体上。全功能哺乳动物合成染色体提供了超过基于病毒的递送系统的几个优势，包括增加的有效负载(payload)尺寸、染色体外维持的事实避免了潜在的宿主细胞破坏、引入的基因的转录沉默和可能的免疫学并发症的避免以及哺乳动物合成染色体可以源自合成染色体待被插入到其中的物种并针对该物种进行定制。然而，尽管已经证明了成功产生哺乳动物合成染色体——包括具有多于一个整合位点的哺乳动物合成染色体——目前用于将多于一个核酸装载到哺乳动物合成染色体上的方法是有限的，并且不存在允许相同标志物基因和药物耐受性基因无限数目的再循环的有效方法。通过流式细胞术有效地鉴定和分离具有适当地整合的递送载体的细胞的能力将极大地改进合成染色体的生物工程化。重要地，使用药物选择的要求的消除减轻了宿主对表达的药物标志物的潜在应答。本专利技术提供了提供这些优势的方法。专利技术概述提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势从以下撰写的详述包括附图中阐释的和所附的权利要求中限定的那些方面将是明显的。本专利技术涵盖用于使用定点重组递送到自主复制核酸上的靶向整合体的无药物选择的方法，所述方法允许使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体。在一些实施方案中，本专利技术提供了一种用于使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体的方法，所述方法包括：使用第一重组系统将第一递送载体整合到自主复制核酸上，所述第一递送载体包含标志物基因和药物耐受性基因和感兴趣的第一核酸；使用具有信号位点α的第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制核酸中切除，其中所述感兴趣的第一核酸保持在所述自主复制核酸上；使用所述第一重组系统将第二递送载体整合到所述自主复制核酸上，所述第二递送载体包含所述标志物基因和所述药物耐受性基因和感兴趣的第二核酸；以及使用具有信号位点β的所述第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制核酸中切除，其中所述感兴趣的第二核酸保持在所述自主复制核酸上。又在其他实施方案中，本专利技术还包括以下步骤：利用第一重组系统将第三递送载体整合到所述自主复制核酸上，所述第三递送载体包含所述标志物基因和所述药物耐受性基因和感兴趣的第三核酸；以及利用具有信号位点γ的第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因切除，其中所述感兴趣的第三核酸保持在所述自主复制核酸上。在优选的实施方案中，重复方法的步骤，直到期望数目的感兴趣的核酸被装载到自主复制核酸上。在这些实施方案的一些方面，自主复制核酸是内源染色体，并且在其他方面，自主复制核酸是合成染色体。在一些方面，合成染色体是哺乳动物染色体，并且在一些方面，合成染色体是人类合成染色体。在一些方面，第一重组系统是λ整合酶系统，并且在一些方面，第二重组系统是Cre/lox重组系统。在一些方面，信号位点α、信号位点β和信号位点γ选自Lox2272、Lox5171、LoxM2和LoxP，但是信号位点α、信号位点β和信号位点γ全都不同。在一些方面，标志物基因是编码荧光蛋白的基因。本专利技术的这些及其他方面和用途将在详述中描述。附图简述图1是根据本专利技术的递送载体的简化图。图2是用于使用定点重组将核酸靶向整合到自主复制核酸上的方法步骤的简化流程图，其中所述方法步骤允许使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体。图3是pNEXUS_TTS装载载体的图谱，其中无启动子的GFP::BSR融合基因侧翼为lox位点。图4是BLoVeL_TTS装载载体的图谱，无启动子的eGFP::BSR融合基因侧翼为lox位点。图5是pFUSLox装载载体的图谱。专利技术详述除非另外指示，本文描述的方法可以采用分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和细胞工程化技术的常规技术和描述，这些都在本领域的技术人员的技术内。这样的常规技术包括寡核苷酸合成、寡核苷酸杂交和连接、细胞转化和转导、重组系统的工程化、转基因动物和植物的创造以及人类基因疗法。合适的技术的具体的说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然也可以使用等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册中，诸如GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries(第I-IV卷)(Green等人编著，1999)；GeneticVariation:ALaboratoryManual(Weiner等人编著，2007)；Sambrook和Russell,CondensedProtocolsfromMolecularCloning:ALaboratoryManual(2006)；以及Sambrook和Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual(2002)(全部来自ColdSpringHarborLaboratoryPress)；ProteinMethods(Bollag等人，JohnWiley&Sons1996)；NonviralVectorsforGeneTherapy(Wagner等人编著，AcademicPress1999)；ViralVectors(Kaplift&Loewy编著，AcademicPress1995)；ImmunologyMethodsManual(Lefkovits编著，AcademicPress1997)；GeneTherapyTechniques,ApplicationsandRegulationsFromLaboratorytoClinic(Meager编著，JohnWiley&Sons本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于使用单个可选择标志物将多于一个递送载体顺序装载到细胞中自主复制核酸上的方法，所述方法包括：使用第一重组系统将第一递送载体整合到所述自主复制核酸上，所述第一递送载体包含标志物基因和药物耐受性基因和感兴趣的第一核酸；使用具有信号位点α的第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制核酸中切除，其中所述感兴趣的第一核酸保持在所述自主复制核酸上；使用所述第一重组系统将第二递送载体整合到所述自主复制核酸上，所述第二递送载体包含所述标志物基因和所述药物耐受性基因和感兴趣的第二核酸；以及使用具有信号位点β的所述第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制核酸中切除，其中所述感兴趣的第二核酸保持在所述自主复制核酸上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.12 US 62/321,7111.一种用于使用单个可选择标志物将多于一个递送载体顺序装载到细胞中自主复制核酸上的方法，所述方法包括：使用第一重组系统将第一递送载体整合到所述自主复制核酸上，所述第一递送载体包含标志物基因和药物耐受性基因和感兴趣的第一核酸；使用具有信号位点α的第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制核酸中切除，其中所述感兴趣的第一核酸保持在所述自主复制核酸上；使用所述第一重组系统将第二递送载体整合到所述自主复制核酸上，所述第二递送载体包含所述标志物基因和所述药物耐受性基因和感兴趣的第二核酸；以及使用具有信号位点β的所述第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制核酸中切除，其中所述感兴趣的第二核酸保持在所述自主复制核酸上。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：使用所述第一重组系统将第三递送载体整合到所述自主复制核酸上，所述第三递送载体包含所述标志物基因和所述药物耐受性基因和感兴趣的第三核酸；以及使用具有信号位点γ的所述第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制核酸中切除，其中所述感兴趣的第三核酸保持在所述自主复制核酸上。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述自主复制核酸是内源染色体。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述自主复制核酸是合成染色体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述合成染色体是哺乳动物合成染色体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述合成染色体是人类合成染色体。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一重组系统是λ整合酶系统。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二重组系统是Cre/lox重组系统。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号位点α和所述信号位点β选自Lox2272、Lox5171、LoxM2和LoxP，但是信号位点α和信号位点β不相同。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述标志物基因是荧光蛋白的基因。11.一种用于使用单个可选择标志物将多于一个递送载体顺序装载到细胞中自主复制的合成染色体上的方法，所述方法包括：使用第一重组系统将第一递送载体整合到所述自主复制的合成染色体上，所述第一递送载体包含标志物基因和药物耐受性基因和感兴趣的第一核酸；使用具有信号位点α的第二重组系统将所述标志物基因和所述药物耐受性基因从所述自主复制的合成染色体中切除，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：爱德华·珀金斯，艾米·格林，
申请(专利权)人：辛普洛德生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US