生物状态机制造技术

提供了通过使用化学控制的DNA切除和倒位操作以编码DNA序列中的状态而在体外和体内构建状态机的基于重组酶的框架。具体地，本公开内容提供了系统，其包含(a)n个丝氨酸重组酶，其中n大于2，以及(b)经改造的核酸，所述经改造的核酸包含用于n个丝氨酸重组酶中的每一个的n‑1对对应重组识别位点(RRS)，其中(b)的n(n‑1)对RRS以重叠配置布置，使得n(n‑1)对RRS中的每一对的两个RRS通过n(n‑1)对RRS中的另一对的至少一个RRS彼此分开，并且其中n(n‑1)对RRS中的每一对的两个RRS之间的重组反转或切除n(n‑1)对RRS中的另一对的至少一个RRS。

Bio state machine

A recombinase-based framework for constructing state machines in vitro and in vivo by using chemically controlled DNA excision and inversion operations to encode states in DNA sequences is provided. Specifically, the present disclosure provides a system comprising (a) n serine recombinases, of which n is greater than 2, and (b) modified nucleic acids comprising N 1 corresponding recombination recognition sites (RRS) for each of the N serine recombinases, in which (b) n (n 1) is overlapped to arrange RRS so that It is obtained that n(n_1) separates at least one RRS of the other pair in RRS by n(n_1) for two RRS of each pair in RRS, and that n(n_1) reverses the recombination between two RRS of each pair in RRS or removes at least one RRS of n(n_1) for another pair in RRS.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物状态机相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年6月10日提交的美国临时申请号62/348,601，2015年11月18日提交的美国临时申请号62/256,829和2015年10月1日提交的美国临时申请号62/235,776的权益，其各自在此通过引用整体并入。
技术介绍
状态机(statemachine)是以许多状态中的任一种存在的系统，其中状态之间的转变由输入(input)控制(1)。状态机的下一个状态不仅由特定的输入决定，还由其当前状态决定。与其中输出仅依赖于当前的输入组合的组合逻辑回路(combinationallogiccircuit)不同，这种依赖于状态的逻辑可以用于产生依赖于输入顺序的输出。
技术实现思路
状态机成为执行依赖于顺序的信息处理的人工和自然计算系统背后的复杂功能性的基础。重组酶可以用于在活细胞中实现状态机，所述状态机记录基因调控事件的身份和顺序，并执行复杂的输入-输出功能。图1描绘了一个状态机，其对于两个输入“A”和“B”的每个“置换子串(permutedsubstring)”进入不同的状态，通过所述状态机我们是指这两个输入的每个不同组合和排序：{无输入，仅A，仅B，A随后是B(A→B)，B随后是A(B→A)}。本文中提供了通过使用化学控制的DNA切除和倒位操作以编码DNA序列中的状态而在活细胞中构建状态机的基于重组酶的框架。这种策略使得能够通过测序和/或PCR以及复杂的基因表达调节来方便地读出状态。该框架通过工程状态机在大肠杆菌(Escherichiacoli)中验证，所述工程状态机使用3个化学输入来控制16个DNA状态。这些状态机能够记录所有输入的时间顺序并执行基因表达的多输入、多输出控制。本文中还提供了使用基于重组酶的状态机的用于基因调控程序的自动化设计的计算工具。本公开内容的可扩展框架应当使得能够实现用于记录和研究组合(combinational)和时间(temporal)事件如何调节复杂的细胞功能和编程复杂的细胞行为的新策略。一些实施方案提供了系统，其包含(a)n个丝氨酸重组酶，其中n大于2；以及(b)经改造的核酸，其包含用于n个丝氨酸重组酶中的每一个的n-1对对应重组识别位点(RRS)，其中(b)的n(n-1)对RRS以重叠配置布置，使得n(n-1)对RRS中的每一对的两个RRS被n(n-1)对RRS中的另一对的至少一个RRS彼此分开，并且其中n(n-1)对RRS中的每一对的两个RRS之间的重组反转或切除n(n-1)对RRS中的另一对的至少一个RRS。在一些实施方案中，n大于或等于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，n个丝氨酸重组酶选自Bxb1、Tp901、A118、PhlF和AraC。在一些实施方案中，RRS选自attB位点、attP位点、经修饰以包含CA二核苷酸的attB位点、经修饰以包含CA二核苷酸的attP位点、经修饰以包含GT二核苷酸的attB位点、经修饰以包含GT二核苷酸的attP位点、经修饰以包含AG二核苷酸的attB位点、经修饰以包含AG二核苷酸的attP位点、经修饰以包含TC二核苷酸的attB位点、经修饰以包含TC二核苷酸的attP位点、经修饰以包含AA二核苷酸的attB位点、经修饰以包含AA二核苷酸的attP位点、经修饰以包含GG二核苷酸的attB位点和经修饰以包含GG二核苷酸的attP位点。在一些实施方案中，系统还包含至少一种经改造的核酸，所述经改造的核酸包含与编码n个丝氨酸重组酶中的至少一个的核苷酸序列有效地连接的至少一个启动子。在一些实施方案中，至少一个启动子是诱导型的。在一些实施方案中，至少一个启动子选自PPhlF、PBAD和PLtetO。在一些实施方案中，(b)的经改造的核酸还包含编码可检测分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述可检测分子是荧光分子(例如，GFP、RFP、BFP、YFP等)。一些实施方案提供了系统，其包含：(a)3个丝氨酸重组酶；以及(b)经改造的核酸，其包含用于3个丝氨酸重组酶中的每一个的两对对应重组酶识别位点(RRS)，其中(b)的6对RRS以重叠配置布置，使得6对RRS中的每一对的两个RRS被6对RRS中的另一对的至少一个RRS彼此分开，并且其中6对RRS中的每一对的两个RRS之间的重组反转或切除6对RRS中的另一对的至少一个RRS。一些实施方案提供了系统，其包含：(a)4个丝氨酸重组酶；以及(b)经改造的核酸，其包含用于4个丝氨酸重组酶中的每一个的3对对应重组酶识别位点(RRS)，其中(b)的12对RRS以重叠配置布置，使得12对RRS中的每一对的两个RRS被12对RRS中的另一对的至少一个RRS彼此分开，并且其中12对RRS中的每一对的两个RRS之间的重组反转或切除12对RRS中的另一对的至少一个RRS。本文中还提供了包含本公开内容的系统的细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞。本文中还提供了使用本公开内容的系统或本公开内容的细胞作为治疗装置或作为诊断装置的方法。一些实施方案提供了使用本公开内容的系统来控制细胞分化的方法。一些实施方案提供了使用本公开内容的系统来检测细胞中的化学信号的方法。附图说明图1.状态机的实例。节点表示状态，箭头表示由输入介导的状态之间的转变。两个输入“A”和“B”的每个可能的置换子串产生唯一的状态。图2A-2D.寄存器(register)上的重组规则。该寄存器被描述为一系列加下划线的字母符号(任意DNA)和形状符号(识别位点)。(A)如果attB-attP对中的位点是反对齐的(anti-aligned)，则它们之间的DNA在重组期间被倒位。(B)如果attB-attP对中的位点是对齐的，则它们之间的DNA在重组期间被切除。(C)多个输入可以驱动在它们自己的attB-attP对上操作的不同的重组酶。在该实例中，输入“A”驱动橙色重组酶，输入“B”驱动蓝色重组酶。(D)给定重组酶的多个正交attB-attP对可以放置在寄存器上。在此不同的形状表示两对attB-attP。每个重组酶可以产生多至6个正交且定向的attB-attP对(31)。图9A-9C给出了关于在此示出的重组反应的更多详细信息。图3A-3B.设计和验证2-输入、5-状态RSM。(A)描绘的是用于实现RSM的两种质粒(顶部)和显示了对于两个输入(aTc和Ara；底部)的每个置换子串的所得寄存器的详细状态图。(B)RSM在大肠杆菌(E.coli.)中的表现。节点表示用输入ATc(橙色箭头)和Ara(蓝色箭头)的置换子串诱导的细胞群。在3次生物学重复中，将培养物在30℃下用饱和浓度的每种输入(250ng/mLATc或1％w/vAra)处理18小时。节点标记表明预期状态(对应于图A)和每个群体中由单个细胞的菌落的Sanger测序确定的处于该状态的细胞的百分比(在所有3次生物学重复中总计至少66个细胞)。图4A-4B.扩大至3-输入、16-状态RSM。(A)用于实现RSM的两种质粒。aTc、Ara和DAPG分别诱导Bxb1、TP901和A118重组酶的表达。输出质粒上的寄存器的详细状态图示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.系统，其包含：(a)n个丝氨酸重组酶，其中n大于2；以及(b)经改造的核酸，其包含用于所述n个丝氨酸重组酶中的每一个的n‑1对对应重组识别位点(RRS)，其中(b)的n(n‑1)对RRS以重叠配置布置，使得所述n(n‑1)对RRS中的每一对的两个RRS被所述n(n‑1)对RRS中的另一对的至少一个RRS彼此分开，并且其中所述n(n‑1)对RRS中的每一对的两个RRS之间的重组反转或切除所述n(n‑1)对RRS中的另一对的至少一个RRS。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.01 US 62/235,776;2015.11.18 US 62/256,829;1.系统，其包含：(a)n个丝氨酸重组酶，其中n大于2；以及(b)经改造的核酸，其包含用于所述n个丝氨酸重组酶中的每一个的n-1对对应重组识别位点(RRS)，其中(b)的n(n-1)对RRS以重叠配置布置，使得所述n(n-1)对RRS中的每一对的两个RRS被所述n(n-1)对RRS中的另一对的至少一个RRS彼此分开，并且其中所述n(n-1)对RRS中的每一对的两个RRS之间的重组反转或切除所述n(n-1)对RRS中的另一对的至少一个RRS。2.权利要求1所述的系统，其中n大于或等于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。3.权利要求1或2所述的系统，其中所述n个丝氨酸重组酶选自Bxb1、Tp901、A118、PhlF和AraC。4.权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述RRS选自attB位点、attP位点、经修饰以包含CA二核苷酸的attB位点、经修饰以包含CA二核苷酸的attP位点、经修饰以包含GT二核苷酸的attB位点、经修饰以包含GT二核苷酸的attP位点、经修饰以包含AG二核苷酸的attB位点、经修饰以包含AG二核苷酸的attP位点、经修饰以包含TC二核苷酸的attB位点、经修饰以包含TC二核苷酸的attP位点、经修饰以包含AA二核苷酸的attB位点、经修饰以包含AA二核苷酸的attP位点、经修饰以包含GG二核苷酸的attB位点和经修饰以包含GG二核苷酸的attP位点。5.权利要求1至4中任一项所述的系统，其中所述系统还包含至少一种经改造的核酸，所述经改造的核酸包含与编码所述n...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢冠达，纳撒尼尔·B·罗凯，
申请(专利权)人：麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国,US