一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒。所述引物包括扩增覆盖BRCA1基因全部24个编码区的正、反向引物，其碱基序列如SEQ ID NO：3～52所示；扩增覆盖BRCA2基因全部27个外显子编码区的正、反向引物，其碱基序列如SEQ ID NO：53～134所示。所述基于NGS技术的检测方法包括：特异性引物与目标模板DNA序列结合、通用引物扩增待测样本目标区域，磁珠纯化文库，对得到的文库进行高通量测序并分析BRCA1和BRCA2基因的突变。本发明专利技术公开的引物、方法和试剂盒可覆盖待检测的所有突变位点，均一性高，同时能够简化实验步骤，提高检测灵敏度，为包括家族性乳腺癌和卵巢癌患者的选择用药，以及为遗传易感性提供指导，有效减少发病风险。

【技术实现步骤摘要】
一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒
本专利技术涉及生物技术的基因突变检测领域，更具体涉及一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒。
技术介绍
乳腺癌的高发病率已经严重威胁女性健康，是女性最常见的癌症之一。乳腺癌可分为散发性和遗传性两大类，目前认为大多数遗传性乳腺癌是由于基因突变引起的，其中BRCA1和BRCA2是迄今为止已发现的最直接的乳腺癌易感基因。研究表明，携带BRCA1和BRCA2基因突变的人群，乳腺癌患病风险和复发风险均高于普通人群，其中携带BRCA1和BRCA2基因致病性突变的女性一生中发生乳腺癌的风险最高可达87％。不仅如此，BRCA1/2基因还是卵巢癌易感基因，据统计BRCA1基因突变携带者一生患卵巢癌的风险是15％～45％，BRCA2基因突变携带者患卵巢癌的风险是10％～20％。BRCA1编码区已经发现的突变有几百种，而BRCA2编码区的突变多达上千种。鉴于BRCA1/2基因突变带来的危害，欧洲肿瘤协会(EMSO)指南(2011)、美国国立综合癌症网络(NCCN)指南(2014)以及《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2013版)》，已将BRCA1和BRCA2基因检测列入其中。BRCA1基因定位于人类17号染色体长臂12-21区，长约80kb，包含24个外显子，其基因产物是1863个氨基酸所构成的磷酸化蛋白质。BRCA2基因位于13号染色体长臂12-13区，长约70kb，包含27个外显子，所编码的蛋白含有3418个氨基酸。BRCA1/2基因都是肿瘤抑制基因，参与细胞周期的调控、基因转录的调控、DNA损伤的修复及凋亡等重要的细胞活动，在维持基因组稳定性中起很重要的作用。一旦BRCA1/2基因发生突变，致使其无法正常编码合成蛋白产物或合成的蛋白产物功能缺失，其抑癌作用将会受到影响，极大的增加癌症发生的风险。此外，BRCA基因的突变还与胰腺癌、恶性黑色素瘤和男性前列腺癌有关；筛选BRCA基因的突变越来越受到研究者的关注。目前医院对于乳腺癌的诊断主要靠检查双侧乳腺、乳腺X线摄影(乳腺钼靶照相)、乳腺磁共振检查(MRI)等，这样诊断发现的乳腺癌一般已到晚期，很难治愈。通过对BRCA1/2基因的检测，寻找其致病突变位点，筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗和风险评估。而此前美国国家癌症研究所发布的《BRCA1andBRCA2:CancerRiskandGeneticTesting》指南也指出：先对家族中罹患乳腺癌或卵巢癌的患者进行基因检测，如果发现该患者带有有害的BRCA1或BRCA2基因突变，那么家族中的其它成员可再进行基因检测，观察是否也有存在有害突变，此种做法有很高的临床价值。目前，普遍应用的BRCA1/2基因突变检测方法主要有以下几种：荧光定量PCR技术，该技术灵敏度高、特异性强、自动化程度高，但是会存在样品污染、假阳性高的情况，并且每次只能检测一种类型的突变，无法完全覆盖BRCA1/2基因全编码区，而BRCA1/2基因检测难度较大，没有热点变异，变异遍布于2个基因的全长。限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)用于检测酶切位点改变的基因，可直接判断基因型，但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测；此外，RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，同样容易污染，难以满足临床检测要求。Sanger测序法，从检测灵敏度上讲，Sanger测序法一般只能检测20％以上突变率的变异，对BRCA1/2基因全部编码序列检测来说，周期较长，成本昂贵，操作复杂，检测通量比较低，很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，很难满足实际应用的需要。因此，临床上迫切需要开发一种相对快捷、操作简便、检测周期短、针对性强、检测结果准确可靠的BRCA1/2基因突变检测方法。而新一代高通量测序(NGS)技术具有很高的敏感性和特异性，随着该技术的成熟及测序成本的持续降低，使用NGS技术进行BRCA1/2基因突变检测是未来市场的趋势。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供了一种基于多重PCR和高通量测序技术的用于检测与人类遗传易感性相关的BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点的引物、方法和试剂盒，旨在解决现有技术中成本高、步骤多，灵敏度低、周期长和易污染等问题。在本专利技术的一方面，提供一种检测BRCA1和BRCA2基因突变的引物，其中通用引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；用于扩增BRCA1基因全编码序列突变位点的特异性引物序列如SEQIDNO.3～52所示；用于扩增BRCA2基因全编码序列突变位点的特异性引物序列如SEQIDNO.53～134所示。本专利技术的另一方面提供一种BRCA1和BRCA2基因突变位点检测试剂盒，主要成分如下：本专利技术的另一方面提供一种BRCA1和BRCA2基因突变位点检测的多重PCR体系：本专利技术再一方面，提供一种BRCA1和BRCA2基因突变位点检测方法，包括以下步骤：A.抽提血液、口腔拭子等受试样品DNA。B.多重PCR法扩增待测样本基因组的目标区域：1)准备无菌、无核酸酶的200μLPCR管，置于冰上。2)配制多重PCR体系，轻轻吹打混匀，离心后将管子置于冰上。3)将管子置于PCR仪中，按以下程序运行：C.使用磁珠纯化文库。D.对得到的文库进行高通量测序并分析BRCA1和BRCA2基因突变信息。本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于高通量测序平台，采用了特异性引物和多重PCR技术，可以快速、准确的实现BRCA1和BRCA2基因突变的检测。本专利技术：(1)提供一种新的引物设计，按100％扩增覆盖BRCA1和BRCA2基因编码区设计，在大幅降低引物二聚体形成的同时，扩增子中容纳更长的真实序列，从根本上提高了引物特异性，提高扩增效率；(2)使用新型多重PCR技术，控制特异性引物只在最初靶标捕获的两个循环中发挥作用，之后会自动切换到由通用引物引导的以相同效率进行的文库扩增，获得均一性非常高的文库；(3)操作简单，5分钟人工操作，即可一步完成BRCA1和BRCA2基因的靶向文库制备工作，节约成本，临床应用范围广；(4)全程无额外开管处理过程，避免由人工带入的污染风险。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1.3％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物示意图。箭头标注处是目标条带区域。50M：50bpDNALadder(Thermo)；T1：Tube1文库构建PCR产物；T2：Tube2文库构建PCR产物。图2.Agilent2100Bioanalyzer对文库进行质检示意图。方框处标注为目标文库区域。图3.Sample7中chr17:41243776CCT>Csanger突变验证标示图。图4.Sample10中chr17:41223094T>Csanger突变验证标示图。图5.Sample11中chr17:41223094T>Csanger突变验证标示图。图6.Sample12中chr17:41223094T>Csanger突变验证标示图。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组检测BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点的引物，其特征在于，包含通用引物和特异性引物。

【技术特征摘要】
1.一组检测BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点的引物，其特征在于，包含通用引物和特异性引物。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的通用引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的特异性引物包括：用于扩增BRCA1基因编码区域的特异性引物序列如SEQIDNO.3～52所示；用于扩增BRCA2基因编码区域的特异性引物序列如SEQIDNO.53～134所示。4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的特异性引物可以被硫代修饰、2-氟代核糖核酸修饰、2'-O-甲基核糖核酸修饰、5-甲基脱氧胞嘧啶修饰、脱氧次黄嘌呤修饰、2-氨基嘌呤修饰、5-溴-脱氧尿嘧啶修饰、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郎秋蕾，周小川，李璐璐，林彬，方超，张瑞静，梁洪，殷楠楠，
申请(专利权)人：杭州链康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33