一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法，包括以下步骤：1)通过PCR法对人生长激素hGH基因进行扩增，得到扩增后的hGH基因；2)将步骤1)中的扩增后的hGH基因连接到pMal‑p2x载体上，得到重组质粒pMal‑hGH；4)将步骤3)中的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导蛋白表达，并确定表达正确后，获得高效表达生长激素的工程菌。本发明专利技术分别采用pMal‑p2x作为载体，获得了重组质粒pMal‑p2x‑GH，pMal‑p2x‑GH的重组质粒的氨基端带有一个MBP蛋白标签，因而将重组质粒导入到大肠杆菌的受体中，可以将hGH和MBP标签进行融合表达，从而将hGH带到外周质空间，更有利于hGH蛋白的纯化，而且由于外周质的氧化环境，hGH蛋白能够正确形成二硫键，使蛋白具有较好的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法及其应用。
技术介绍
人生长激素(humangrowthbormone，hGH)，其成熟形式是去除了信号肽的，由191个氨基酸组成的亲水性单链球蛋白，其相对分子量约为22kD，等电点为4.9，分子内存在两对二硫键，分别位于Cys53与Cys165之间和Cys182与Cys189之间。hGH是由人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种重要的非糖基化蛋白质激素。脑垂体在下丘脑生长激素释放因子的刺激下，便能释放生长激素，通过血液运输到各个器官组织。hGH的受体遍及人的全身，因此生长激素能够影响几乎所有的组织类型和细胞。其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调节蛋白质，糖类及脂肪的代谢等。临床上主要用于治疗侏儒症，近年来的研究发现hGH还能治疗烧伤、创伤、骨折及骨质疏松等多种疾病。生长激素的种属特异性强，不同物种的生长激素差异很大，不能混用。因此，传统临床应用的生长激素只能是从人脑的垂体中提取的，一个人的垂体最多只能提取出3-5mg的人生长激素。来源受限造成价格昂贵，无法大量医用。随着分子生物学和基因工程的发展，生产重组蛋白的技术突飞猛进，使得大规模生产hGH成为现实。这样能够大大地满足了社会的需求。由于生长激素不需要糖基化修饰，使得大肠杆菌成为了表达hGH的理想载体。传统的利用大肠杆菌表达重组hGH，有两种不同技术途径，一种是生产胞内型的重组人生长激素，在胞内的尽管表达量较高，但是提纯比较麻烦，另外重组蛋白容易降解，并且不能很好的形成二硫键；另一种是生产分泌型的重组人生长激素，纯化步骤简单，杂蛋白干扰少，氧化型的环境有利于二硫键形成，但是通常其分泌效率不高，大部分的表达蛋白可能滞留在胞内。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达量高，且易提取纯化的高效表达生长激素的工程菌的制备方法及其应用。本专利技术这种高效表达生长激素的工程菌的制备方法，包括以下步骤：1)通过PCR法对人生长激素hGH基因进行扩增，得到扩增后的hGH基因；2)将步骤1)中的扩增后的hGH基因连接到pMal-p2x载体上，得到重组质粒pMal-hGH；3)将步骤2)中的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导蛋白表达，并确定表达正确后，获得高效表达生长激素的工程菌。所述的人生长激素hGH基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述hGH扩增基因的上游引物1如SEQIDNO：2所示；下游引物2如SEQIDNO：3所示。所述的工程菌在细胞外周质表达人生长激素hGH中的应用。所述的人生长激素hGH的氨基酸序列如SEQIDNO：10。本专利技术的有益效果：MBP蛋白是由大肠杆菌基因malE表达的一个前体蛋白，带有一个26个氨基酸的信号肽，该信号肽能够帮助它通过大肠杆菌的SecYEG转运系统分泌到外周质空间，参与大肠杆菌对麦芽糖吸收和有效利用。MBP蛋白除了帮助融合蛋白分泌表达到外周质空间之外，它还具有增强重组蛋白的可溶性的特点，能够降低蛋白的翻译速率，有利于蛋白的正确折叠，避免重组蛋白形成包涵体或者沉淀；另外它还作为亲和层析的标签在蛋白纯化领域被广泛使用，它和麦芽糖亲和柱特异、高效结合，进一步方便蛋白纯化。本专利技术分别采用pMal-p2x作为载体，获得了重组质粒pMal-hGH，pMal-hGH的重组质粒的氨基端带有一个MBP蛋白标签，因而将重组质粒导入到大肠杆菌的受体中，可以将hGH和MBP标签进行融合表达，从而将hGH带到外周质空间，更有利于hGH蛋白的纯化，而且由于外周质的氧化环境，hGH蛋白能够正确形成二硫键，使蛋白具有较好的活性。附图说明图1实施例3中hGH蛋白的表达情况分析图；其中：泳道1为蛋白marker，泳道2和3为pET22b-hGH诱导后的样品，泳道4和5为未诱导的对照菌液，泳道6和7为pMal-hGH诱导后的样品。图2实施例3中hGH蛋白表达位置的确定；其中：泳道1为蛋白marker，泳道2-5分别为pET22b-hGH菌体经上清液1和上清液2处理后得到蛋白上清液；泳道6-9分别为pMal-hGH菌体经上清液1和上清液2处理后得到蛋白上清液；泳道10-11代表pET22b-hGH处理之后的细胞裂解液；泳道12-13代表pMal-hGH处理之后的细胞裂解液。图3实施例4中切除BMP标签蛋白后的hGH蛋白测试图；其中：泳道1为蛋白marker；泳道2-6分别为收集的被ppase酶酶切之后的hGH；上面的一条多余的条带为过量的ppase酶。图4实施例5中hGH蛋白分子筛纯化结果,其中：A.显示hGH的分子筛色谱图；B.取fractionnumber：15-22进行SDS-PAGE分析图。图5.实施例6中hGH蛋白分子内活性二硫键的分析图；其中：A.hGH蛋白样品在reduced和no-reduced下SDS-PAGE检测；B.使用hGH抗体对hGH蛋白进行定性检测。图中★代表释放的hGH蛋白。具体实施方式实施例11)以HG16122-CF(http://www.sinobiologicalcdn.com/reagent/HG16122-CF.pdf)为模板质粒(SEQIDNO：1所示)，以含HRV3C蛋白酶切位点的上游引物1和含PST1限制性内切酶酶切位点下游引物2，对hGH基因进行PCR扩增，纯化后，得到扩增后hGH基因，其中：上游引物1为：CTGGAAGTCCTGTTTCAGGGACCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG(SEQIDNO：2所示)；下游引物2为：CGGCCAGTGCCAAGCTTGCCTGCAGCTAGAAGCCACAGCTGCCCTCC(SEQIDNO：3所示)；KODFXPCR反应体系为：94℃2min，98℃10sec，62℃30Sec，68℃50sec，重复35cycles；68℃延伸5min；4℃hold。2)使用PST1酶切位点同源臂的反向互补序列上游引物1和含HRV3C蛋白酶切位点反向互补序列下游引物2，通过PCR扩增获得pMal-p2X载体骨架片段，切胶回收之后和hGH基因片段进行同源重组反应。将hGH基因插入到pMal-p2x(HRV3C)的HRV3C蛋白酶切位点和PST1限制性内切酶酶切位点之间尽量避免引入非天然的氨基酸，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆，测序正确后，得到重组质粒命名为pMal-hGH。上游引物3为：CCAGTGCCAAGCTTGCCTGCAG(SEQIDNO：4所示)；下游引物4为：GGGTCCCTGAAACAGGACTTCCAGC(SEQIDNO：5所示)；PrimestarPCR反应体系为：95℃2min，98℃10sec，55℃15sec，72℃1min，重复30cycles；72℃延伸3min；4℃hold。3)将测序正确的重组质粒与大肠杆菌感受态细胞(E.coliDH5α)混匀，放置在冰浴中30min，42℃水浴下90s，取出后再次冰浴5min；接着将其加入到LB(Luria-Bertani培养基)液体培养基，并在37℃，150rpm条件下，振荡培养1h；取菌液于含50mg/L卡那霉素的LB固体培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法，包括以下步骤：1)通过PCR法对人生长激素hGH基因进行扩增，得到扩增后的hGH基因；2)将步骤1)中的扩增后的hGH基因连接到pMal‑p2x载体上，得到重组质粒pMal‑hGH；3)将步骤2)中的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导蛋白表达，并确定表达正确后，获得高效表达生长激素的工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法，包括以下步骤：1)通过PCR法对人生长激素hGH基因进行扩增，得到扩增后的hGH基因；2)将步骤1)中的扩增后的hGH基因连接到pMal-p2x载体上，得到重组质粒pMal-hGH；3)将步骤2)中的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导蛋白表达，并确定表达正确后，获得高效表达生长激素的工程菌。2.根据权利要求1所述的工程菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王库强，王峰，
申请(专利权)人：湖南百尔泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43