高效表达山羊生长激素ＧＨ的乳腺特异性表达载体制造技术

本发明专利技术公开了高效表达山羊生长激素ＧＨ的乳腺特异性表达载体，属于生物工程技术领域。ＧＨ的ｃＤＮＡ序列见ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１。生长激素既可以促进乳腺导管形成，也可以促进山羊的乳腺上皮细胞的增殖，从而增加产奶量。将本发明专利技术构建的乳腺特异性表达载体ｐｃＧＨ采用脂质体法，导入体外培养的人乳腺癌细胞Ｂｃａｐ－３７中，在转染后收集细胞培养上清；采用ＥＬＩＳＡ的方法检测细胞培养上清中的ＧＨ含量。结果显示与未转染ｐｃＧＨ的空白组细胞相比，转染ｐｃＧＨ组细胞ＧＨ表达量显著提高。表明ｐｃＧＨ载体可已在乳腺细胞上成功表达ＧＨ，为下一步生产转ｇｈ基因奶山羊奠定坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种高效表达山羊生长激素ＧＨ的乳腺特异性表达载体，其ｇｈ基因具有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示的序列，其构建方法包括：１）萨能奶山羊生长激素ｇｈ的克隆参照Ｇｅｎｂａｎｋ登陆号：Ｙ００７６７山羊生长激素ｇｈ基因的ｃＤＮＡ序列设计一对扩增生长激素ｃＤＮＡ的引物，并在上游引物上引入ＥｃｏＲＩ限制性酶切位点，下游引物上引入ＳａｌＩ限制性酶切位点：上游引物ＺＰ３：５’－ＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡ－３’下游引物ＺＰ４：５’－ＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＣＧ－３’以萨能奶山羊肝脏组织的总ＲＮＡ为模板，经反转录合成ｃＤＮＡ第一链后进行ＰＣＲ扩增；ＰＣＲ反应体系为２５ｕＬ，ＰＣＲ反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ，９５℃３０ｓｅｃ，６５℃３０ｓｅｃ，７２℃４０ｓｅｃ，３０个循环，７２℃１０ｍｉｎ，４℃１０ｍｉｎ；将ＰＣＲ产物连接到ｐＭＤ１９－Ｔ载体上，送交上海生工测序。测序后获得具有完整编码区的萨能奶山羊生长激素ｇｈ基因的ｃＤＮＡ序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１；２）萨能奶山羊β－乳球蛋白５端和３端的克隆参照已发表的山羊的β－乳球蛋白序列Ｇｅｎｂａｎｋ登陆号：Ｚ３３８８１，设计一对扩增β－乳球蛋白５端的引物，并在上游引物上引入Ｘｈｏ　Ｉ限制性酶切位点，在下游引物上引入ＥｃｏＲＩ限制性酶切位点，引物序列如下：上游引物ＺＰ１：５’－ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＧ－３’下游引物ＺＰ２：５’－ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＧＣＣＴＴＴＣＡＴＧ－３’设计一对扩增β－乳球蛋白３端的引物，并在上游和下游引物上分别引入ＳａｌＩ限制性酶切位点，引物序列如下：上游引物ＺＰ５：５’－ＴＡＴＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＴ－３’下游引物ＺＰ６：５’－ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴ－３’以萨能奶山羊肝脏组织提取的ＤＮＡ为模板，用合成的ＺＰ１、ＺＰ２引物ＰＣＲ扩增β－乳球蛋白５端，ＰＣＲ反应体系为２５ｕＬ，ＰＣＲ反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ，９５℃３０ｓｅｃ，６１℃３０ｓｅｃ，７２℃１５０ｓｅｃ，３０个循环，７２℃１０ｍｉｎ，４℃１０ｍｉｎ；将ＰＣＲ产物连接到ｐＭＤ１９－Ｔ载体上，测序后获得具有萨能奶山羊β－乳球蛋白５端的ＤＮＡ序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２；用合成的ＺＰ５、ＺＰ６...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，张强，庾庆华，林建，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]