本发明专利技术属医药和生物工程学领域，涉及人α干扰素亚型在制备抗乙肝病毒药物中的应用，本发明专利技术针对现有技术中用于治疗慢性乙型肝炎的人基因组编码干扰素亚型IFN‑α2应答率较低而副作用较大的问题，经体外病毒转染及感染模型鉴定提供了包括IFN‑α14，IFN‑α6和IFN‑α1的多种α干扰素亚型，经试验显示，所述的多种α干扰素亚型相较IFN‑α2具有更强的抗乙肝病毒活性，且在抗病毒浓度下无细胞毒效应，其中IFN‑α14具有最强的抗HBV活性。本发明专利技术所述的多种α干扰素亚型可用于制备新的抗乙肝病毒效应显著好的抗乙肝病毒药物。
Application of human interferon-alpha subtypes in the preparation of anti-hepatitis B drugs
The invention belongs to the field of medicine and bioengineering, and relates to the application of human interferon alpha subtype in the preparation of anti-hepatitis B drugs. The invention aims at the problem of low response rate and high side effects of human genome coding interferon alpha 2 subtype for chronic hepatitis B in the existing technology, and provides the identification of virus transfection and infection model in vitro, including IFN alpha 14, IFN alpha 6 and I. Many subtypes of interferon alpha of FN_alpha 1 were tested. The results showed that the various subtypes of interferon alpha had stronger anti-hepatitis B virus activity than IFN_alpha 2, and had no cytotoxic effect at the antiviral concentration. Among them, IFN_alpha 14 had the strongest anti-HBV activity. The various alpha interferon subtypes of the invention can be used to prepare new anti-hepatitis B virus drugs with remarkable anti-hepatitis B virus effect.
【技术实现步骤摘要】
人α干扰素亚型在制备抗乙型肝炎病毒药物中的用途
本专利技术属医药和生物工程学领域，涉及人类α干扰素新的制药用途，具体涉及人α干扰素在制备抗乙型肝炎病毒药物中的用途，所述的药物能用于降低或清除乙肝病毒感染肝细胞中病毒表面抗原(HBsAg)及病毒基因组DNA(cccDNA)。
技术介绍
现有技术公开了乙型肝炎病毒(HBV)是严重危害人类健康的重要病原体。据估计，目标全球大约有2.4亿HBV携带者，其中我国现有慢性HBV感染者近8000万人。虽然目前已有可有效预防HBV感染的乙肝疫苗，但是每年仍有几十万的新增乙肝慢性感染病例，同时每年有几十万人死于慢乙肝导致的肝脏疾病。由于特异性治疗手段的缺乏，如何达到慢乙肝功能性治愈，即乙肝表面抗原(HBsAg)转阴，乃至完全治愈即病毒基因组DNA(cccDNA)清除，仍是业内面对的难题，医疗实践中，很多患者为控制病毒感染及致病需终身服用核苷(酸)类抗病毒药物，这给患者及其家庭造成了严重的经济负担及降低了患者的生活质量。干扰素(Interferon,IFN)于1957年最初被发现并命名，是一类具有直接抗病毒效应、免疫调节作用的细胞因子，在宿主抗病毒免疫应答过程中发挥着关键作用。目前已鉴定的IFNs有十几种，根据所结合受体的不同，IFNs大致被分为I和II两型：I型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β(IFN-λ一般归为III型干扰素)，II型干扰素则主要是IFN-γ；其中，与宿主抗病毒天然免疫应答密切相关的是IFN-α，其通过特异性结合到细胞表面的IFNAR启动下游JAK-STAT信号通路的转导进而诱导干扰素刺激基因(ISGs)的转录表达而发挥抗病毒作用。随着基因工程技术的出现及发展，重组人IFN-α被生产及应用于治疗病毒性肝炎等疾病。研究显示，相较另一类用于治疗慢乙肝的药物——核苷(酸)类似物，IFN-α及其PEG化产物(PEG-IFN-α)除了具有直接抗病毒作用外还兼具免疫调节作用，因此具有更高的乙肝表面抗原(HBsAg)转阴乃至血清转换的功用，且在部分病人中应答持续更久；然而，有临床研究统计表明IFN-α治疗慢乙肝的效率仍显较低，即使采用长效干扰素治疗48个月，HBe抗原(HBeAg)阳性患者仅约三成可产现HBeAg转阴，而HBsAg的转阴率则低于5％，为此，亟待优化现有及开发新型抗乙肝病毒手段。据知，包括IFN-α2在内，已有13种人类IFN-α亚型被陆续鉴定，它们的编码基因均位于人9号染色体。各亚型α干扰素间具有较多相似的结构域，但有约30％部分序列为非保守。目前研究较多及临床使用的为早期鉴定发现的IFN-α2，包括IFN-α2a/2b(2a与2b间差一个氨基酸)，而对于其余多数IFN-α亚型的功能及其在进化上的意义及抗病毒功能差异鲜有研究报道。部分报道表明，虽然不同亚型IFN-α均通过与I型干扰素受体的两个亚基IFNAR1和IFNAR2结合而发挥作用，但由于与两亚基的亲和力各异，各亚型IFN-α激活下游经典或旁路信号通路的方式及程度存在差异；同时，不同病毒及不同细胞对于IFN亚型的敏感性也存在不同。基于现有技术的现状，本专利技术经针对不同亚型人IFN-α间抗HBV感染效应的比较研究，发现了可显著抑制乙肝病毒复制的干扰素亚型并对机制进行了研究，拟提供人类α干扰素新的制药用途，具体涉及人类α干扰素在制备抗乙型肝炎病毒药物中的用途，本专利技术有利于在科学上增进对α干扰素抗病毒机制的认识，更为开发基于干扰素亚型的新型治疗慢乙肝手段奠定基础。
技术实现思路
本专利技术目的是基于现有技术的现状，提供人类α干扰素新的制药用途，本专利技术通过不同亚型人IFN-α间抗HBV效应的比较研究，筛选鉴定了相较现有技术的IFN-α2抗HBV效应更强的人IFN-α亚型，具体的，本专利技术提供了人α干扰素在制备抗乙型肝炎病毒药物中的用途，本专利技术有利于在科学上增进对α干扰素抗病毒机制的认识，更为开发基于特定α干扰素亚型的新的干预慢乙肝手段奠定基础。本专利技术采用HBV质粒转染肝癌细胞系及HBV感染细胞模型对经由原核表达的13种已知人类IFN-α亚型重组蛋白的抗病毒效果进行了筛选，结果显示，相较目前临床所使用的IFN-α2，多种其它IFN-α亚型具有更强的抗HBV效果，具体抗病毒活性排序为IFN-α14>α1,α6,α17,α21>α2,α5,α7,α8>α4,α10,α16。本专利技术所述的其它IFN-α亚型为除IFN-α2之外的其他人基因组编码α干扰素亚型，本专利技术中优选IFN-α14，α1,α6,α17,α21，α5,α7,α8，α4,α10,α16；本专利技术中最优选IFN-α14。本专利技术所述的其它IFN-α亚型重组蛋白的氨基酸序列获取自人基因组，其氨基酸序列如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3所示。本专利技术采用HBV感染的原代肝细胞系统进一步验证比较了IFN-α14,α6和IFN-α2的抗病毒效果及差异，实验证实IFN-α14和α6对HBeAg、HBsAg及HBVDNA的抑制效果的半数有效抑制浓度(IC50)相较IFN-α2低十至百倍，而在相应抗病毒浓度及与IFN-α2相同的使用浓度下均无细胞毒性效应；与文献报道的IFN-α可降解HBV作为转录复制模板的基因组DNA(cccDNA)比较，本专利技术的结果显示，IFN-α14相较IFN-α2具有更强的下调cccDNA的效应。本专利技术涉及的免疫印迹、干扰素刺激反应原件荧光报道系统及高通量基因芯片及定量PCR数据进一步阐明，相较IFN-α2，特定IFN-α亚型IFN-α14和α6一方面对经典JAK-STAT1/STAT2通路具有更强的激活效应，另一方面对旁路JAK＝STAT3/STAT6通路有相对特异性激活效应；同时，虽然在ISGs诱生广度上与IFN-α2差别不大，但其在诱导部分已报道与干扰素疗效相关的ISGs亚群包括GBP5等基因的产生上具有相对特异性的效应。本专利技术实验结果表明，多种IFN-α亚型在抑制HBV表面抗原、e抗原和病毒DNA产生中具有优于当前所使用IFN-α2的活性，其中IFN-α14具有最强的抗HBV活性，且均无细胞毒效应，本专利技术提供了IFN-α亚型在制备治疗慢性乙肝新型药物中的应用基础，尤其是在制备降低或清除乙肝病毒慢性感染患者HBV表面抗原及cccDNA的药物中的用途。为便于理解，以下将通过具体的附图对本专利技术所述多种人IFN-α亚型相较IFN-α2具有更优抗HBV活性进行详细地描述；需指出的是，该附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出修改，这些修改也纳入本专利技术的范围内。附图说明图1.HBV质粒转染系统及HBV感染系统中各IFN-α亚型抗HBV效应的评价及比较，其中，图1A.HBV质粒转染细胞模型；图1B.基于HepaRG细胞的HBV感染模型；图1C.基于人原代肝细胞(PHH)的HBV感染模型。图2.IFN-α14，IFN-α6及IFN-α2抑制HBV的半数有效抑制浓度的测定及比较。图3.IFN-α14对HBVRNA及cccDNA的下调作用。图4.IFN-α亚型对经典JAK-STAT1/STAT2通路及旁路的激活效应比较。图5.IFN-α14，IFN-α6及IFN-α2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人α干扰素亚型在制备治疗慢性乙肝病毒感染药物中的用途；所述的人α干扰素亚型选自，人α干扰素亚型α14，α1,α6,α17,α21，α5,α7,α8，α4,α10,和α16。
【技术特征摘要】
1.人α干扰素亚型在制备治疗慢性乙肝病毒感染药物中的用途；所述的人α干扰素亚型选自，人α干扰素亚型α14，α1,α6,α17,α21，α5,α7,α8，α4,α10,和α16。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的人α干扰素亚型为人α干扰素亚型α14，其编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的人α干扰素亚型为人α干扰素亚型IFN-α6和IFN-α1，其编码氨基酸序列分别如SEQIDNO.2和3所示。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的人α干扰素亚型重组蛋白具有抑制感染乙肝病毒的肝细胞中病毒表面抗原(HBsAg)，e抗原(HBeAg)病毒蛋白及病毒DNA和mRNA产生的...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁正宏，陈捷亮，李亚明，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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