用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体及制备方法技术

本发明专利技术公开一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体及制备方法，所述AATase单克隆抗体是由稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化而成；所述杂交瘤细胞株按如下方法制备：以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后接种于HAT选择培养基中，形成杂交瘤细胞株；采用间接ELISA法筛选出阳性细胞株；用有限稀释法筛选出能稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株。

AATase Monoclonal Antibody for Isolation of Oyster Granulosa Cells and Its Preparation Method

The present invention discloses an AATase monoclonal antibody for sorting long oyster granulosa cells and a preparation method. The AATase monoclonal antibody is immunized with a hybridoma cell strain stably secreting AATase antibody, and the ascites of mice is purified. The hybridoma cell strain is prepared by following methods: immunizing mice with recombinant protein shown in amino acid sequence such as SEQ ID NO.3, and taking mice. Splenic cells fused with SP2/0 myeloma cells were inoculated into HAT selective medium to form hybridoma cell lines. Positive cell lines were screened by indirect ELISA method and hybridoma cell lines which could stably secrete AATase antibody were screened by limited dilution method.

【技术实现步骤摘要】
用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体及制备方法
本专利技术属于分子生物学和细胞生物学
，尤其涉及一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体及制备方法。
技术介绍
血淋巴细胞是贝类固有免疫系统的核心和基础，不同的血淋巴细胞亚群在免疫应答中具有不同的功能。基于血淋巴细胞的物理特征，长牡蛎血淋巴细胞可分为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞三大类，研究表明，颗粒细胞是发挥主要免疫功能的细胞亚群。但迄今为止，贝类血淋巴细胞的分离鉴定因缺乏相应的标志分子而一直存在困难。虽然密度梯度离心、流式细胞术、免疫磁珠法等分离细胞亚群的方法相继应用于贝类血淋巴细胞的分选，但效果不甚理想。迄今为止，无法进一步研究颗粒细胞生物学特性、生理学特性及免疫学功能。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体及制备方法。本专利技术的技术解决方案是：一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体，其特征在于：所述AATase单克隆抗体是由稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化而成；所述杂交瘤细胞株按如下方法制备：以氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的重组蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后接种于HAT选择培养基中，形成杂交瘤细胞株；采用间接ELISA法筛选出阳性细胞株；用有限稀释法筛选出能稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株。一种上述用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.用引物P1和P2对长牡蛎CgAATase基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQIDNO.3所示；b.将PCR扩增产物纯化回收，与pMD19-T载体连接，转化后筛选阳性克隆；提取质粒，并使用NdeI和XhoI对质粒进行双酶切；回收目的片段，与pET-22b(+)载体经NdeI和XhoI酶切后通过T4连接酶连接，转化得到重组子；c.将所述重组子转入大肠杆菌表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，得到氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示的重组蛋白；d.将重组蛋白混合弗氏佐剂充分乳化，经小鼠四次免疫及一次加强免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；e.采用间接ELISA法筛选出阳性细胞株；f.用有限稀释法筛选出能稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株；g.由稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化而成。本专利技术通过对长牡蛎透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞单细胞转录组数据分析发现，CgAATase基因呈现出在颗粒细胞中特异性高表达的特点，从而利用血细胞亚群差异性分子AATase制备单克隆抗体。所得到的AATase单克隆抗体只针对长牡蛎颗粒细胞表面的一种抗原决定簇，具有由于多克隆抗体的特异性，可用于颗粒细胞的高纯度分离，为进一步研究颗粒细胞的免疫功能，探究颗粒细胞的发生、成熟分化机制等提供技术支持。附图说明图1为本专利技术实施例的AATase基因的克隆图。图2为本专利技术实施例的AATase基因编码区体外原核重组表达和纯化图。图3为本专利技术实施例的单克隆抗体与重组蛋白的WesternBlot图。图4为本专利技术实施例的单克隆抗体与组织蛋白的WesternBlot图。图5为本专利技术实施例的单克隆抗体亚细胞定位图。图6为本专利技术实施例的单克隆抗体分离细胞图。图7为本专利技术实施例的单克隆抗体流式细胞仪检测图。具体实施方式一.AATase基因编码区体外原核重组蛋白表达和纯化1.重组载体的构建本专利技术中采用的重组载体为Novagen公司的pET-22b(+)原核表达载体。通过PCR技术，用特定引物P1和P2对长牡蛎AATase基因编码区片段进行扩增。PCR反应条件为：首先95℃预变性5min，然后进入下列循环：95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接，转化后筛选阳性克隆；提取质粒，并使用NdeI和XhoI对质粒进行双酶切；回收目的片段，并与经NdeI和XhoI酶切的表达载体pET-22b(+)通过T4连接酶连接，完成重组质粒的构建。AATase基因编码区扩增片段如图1所示有1431bp。2.重组蛋白的表达将构建好的重组质粒转化表达宿主菌大肠杆菌Transetta(DE3)中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于500mL的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至OD600=0.4~0.6。加入IPTG（终浓度1mmolL-1），继续培养4小时后于4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，于-80℃冻存备用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μlTBS和20μl的5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。3.重组蛋白的纯化重组蛋白在变性条件下采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，即获得AATase基因的重组蛋白。具体操作步骤如下：（1）镍琼脂糖凝胶FF装柱（1.6×20cm），柱床体积为5ml；（2）用缓冲液I（50mmolL-1Tris-HCl，0.5molL-1NaCl，8molL-1尿素，pH7.4）平衡2~5个床体积，流速为2mlmin-1；（3）经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30min，12000rpm，4℃离心30min，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mlmin-1；（4）用缓冲液I再洗2-5个床体积，流速为2mlmin-1；（5）用含有50mmolL-1咪唑的缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2mlmin-1；（6）依次用含有100mmolL-1、200mmolL-1咪唑的缓冲液I洗脱杂蛋白，流速为2mlmin-1；（7）用400mmolL-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，流速为2mlmin-1，收集；（8）用SDS-PAGE检测获得蛋白的纯度；（9）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mlmin-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.4mM氧化谷胱甘肽、1mMEDTA、50mMTris-HCl、100mMNaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、1M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油，每次在4℃透析12h。分装，存于-80℃冰箱。SDS-PAGE结果如图2所示。结果表明，含有重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导后可产生分子量约54.46kDa的特异条带,大小与AATase基因分子量相一致，在变性条件下经纯化得到单一条带，即为重组蛋白。二.AATase基因杂交瘤细胞的制备利用上述原核表达获得的重组蛋白免疫3只Balb/C小鼠，第一次免疫用重组蛋白与完全弗氏佐剂1:1混合，充分乳化，腹腔注射小鼠，2周后，不完全佐剂代替完全佐剂，同法进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体，其特征在于：所述AATase单克隆抗体是由稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化而成；所述杂交瘤细胞株按如下方法制备：以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后接种于HAT选择培养基中，形成杂交瘤细胞株；采用间接ELISA法筛选出阳性细胞株；用有限稀释法筛选出能稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体，其特征在于：所述AATase单克隆抗体是由稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化而成；所述杂交瘤细胞株按如下方法制备：以氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的重组蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后接种于HAT选择培养基中，形成杂交瘤细胞株；采用间接ELISA法筛选出阳性细胞株；用有限稀释法筛选出能稳定分泌AATase抗体的杂交瘤细胞株。2.一种如权利要求1所述用于分选长牡蛎颗粒细胞的AATase单克隆抗体的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.用引物P1和P2对长牡蛎CgAATase基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，董迷忍，宋小瑞，王伟林，王玲玲，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21