一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术和疫苗制备技术领域，公开了一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由rS、rF和IBV M基因分别转入杆状病毒表达系统，再将分别包含rS、rF和M基因的杆状病毒表达系统转入昆虫细胞内组装而成，所述rS基因由IBV S1基因和IBV S‑TM/CT基因连接而成，所述rF基因由NDV Fecto基因和IBV S‑TM/CT基因连接而成。本发明专利技术还公开了该病毒样颗粒的制备方法和应用。本发明专利技术的优点在于，该病毒颗粒克服了以往IB和ND疫苗免疫力低下、不能有效保护禽类的缺陷。本发明专利技术提供的病毒样颗粒的制备方法简单易操作，稳定性好，便于推广。

A virus-like granule of avian infectious bronchitis and Newcastle disease, its preparation method and Application

The invention belongs to the field of biotechnology and vaccine preparation technology, and discloses a virus-like particle of avian infectious bronchitis and Newcastle disease. The virus-like particle is transferred into baculovirus expression system by rS, rF and IBV M genes respectively, and then assembled into insect cells by transforming baculovirus expression system containing rS, rF and M genes respectively. The rS gene is composed of IBV S1 gene and IBV M gene. The rF gene is linked by NDV Fecto gene and IBV S TM/CT gene. The invention also discloses the preparation method and application of the virus-like particles. The advantages of the invention are that the virus particles overcome the defects of low immunity of IB and ND vaccines in the past and can not effectively protect poultry. The preparation method of virus-like particles provided by the invention is simple and easy to operate, has good stability and is convenient for popularization.

【技术实现步骤摘要】
一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用
本专利技术属于生物技术和疫苗制备
，具体涉及一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用。
技术介绍
禽传染性支气管炎(infectiousbronchitis，IB)和新城疫(newcastledisease，ND)是家禽养殖过程中极为常见的、高度接触性传染疾病，是危害全球养禽业的重大传染病。其病原分别为禽传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus，IBV)和新城疫病毒(newcastlediseasevirus，NDV)。目前，生产应用中针对IBV和NDV的主要控制手段为接种传统疫苗(分别接种两种疫苗或接种二联苗)，但传统疫苗(灭活疫苗和弱毒疫苗)存在一定的缺点，例如灭活疫苗不能有效的诱导机体产生细胞免疫，保护效力低，而弱毒疫苗则会发生突变，甚至与野毒株重组出现新毒株，导致免疫失败。目前，市面上也有一些IBV和NDVDNA疫苗，但大都免疫效力底下，不能提供有效的保护。因此，研发更为安全、高效的新型疫苗并且寻找能够有效提高疫苗免疫效果的方法是IBV和NDV防控研究的重要方向。病毒样颗粒(viruslikeparticles，VLPs)是不含有病毒遗传物质、但具有病毒粒子结构的空壳。由于缺失了遗传物质，故VLPs不具备感染性但可作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，在疫苗领域具有广阔发展前景。虽然基于VLPs的疫苗具有重要的经济价值，但目前市面上还没有对于IB和ND的VLPsDNA疫苗，如果将ND和IB有效整合到Bac-to-Bac系统上，必将克服以往IB和ND疫苗免疫力低下，不能有效保护禽类的缺陷，为IB和ND的疫苗做出巨大的贡献。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种IB和ND的DNA的亚单位疫苗，具体为禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用。本专利技术所采用的技术方案为：IBV基因组全长约27.6kb，编码15个非结构蛋白(non-structuralproteins，NSPs)和四种结构蛋白：纤突蛋白(spikeglycoprotein，S)，小膜蛋白(smallmembraneprotein，E)，膜蛋白(membraneglycoprotein，M)和核衣壳蛋白(phosphorylatednucleocapsidprotein，N)。M糖蛋白是病毒包膜中最丰富的蛋白质，在CoV装配和萌芽的过程中起着核心作用。E蛋白尽管包膜的最小成分也在CoV包膜形成中起决定性作用；S糖蛋白在翻译后被切割成两个不同的功能性亚基(S1和S2)，在CoV表面上形成独特的纤突结构，并负责受体结合宿主细胞膜表面受体并确定宿主向性，其中S1亚基可诱导机体产生病毒中和抗体(5)，而S2亚基则通过跨膜结构域(TM)将S蛋白锚定在病毒颗粒表面，并与M糖蛋白(6)共价相互作用形成羧基末端结构域(CT)。NDV的基因组全长约15kb，编码六种蛋白：核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)、基质蛋白(matrixprotein，M)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、融合蛋白(fusionprotein，F)、血凝素-神经氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidaseprotein，HN)以及聚合酶(largepolymeraseprotein，L)，其中F蛋白为NDV的主要抗原蛋白。基于前述原理，本专利技术的方案如下：一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由rS、rF和IBVM基因分别转入杆状病毒表达系统，再将分别包含rS、rF和M基因的杆状病毒表达系统转入昆虫细胞内组装而成，所述rS基因由IBVS1基因和IBVS-TM/CT基因连接而成，所述rF基因由NDVFecto基因和IBVS-TM/CT基因连接而成。具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述IBVS1基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBVS-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述IBVS1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述IBVS-TM/CT基因的序列如SEQIDNO.2所示。具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述NDVFecto基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBVS-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述NDVFecto基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述IBVM基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4。具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述杆状病毒表达系统中杆状病毒穿梭质粒为pFastbac系列载体，所述杆状病毒表达系统中感受态细胞为DH10Bac，所述昆虫细胞为Sf9。一种权利前述的病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：(1)扩增IBVS1、IBVS-TM/CT、NDVFecto和IBVM基因；(2)连接IBVS1和IBVS-TM/CT，得到rS基因，连接NDVFecto和IBVS-TM/CT，得到rF基因；(3)将所述rS、rF和IBVM基因转入杆状病毒表达系统，得到分别包含述rS、rF和IBVM基因的重组杆状病毒表达系统；(4)将所述分别包含述rS、rF和IBVM基因的重组杆状病毒表达系统共转染入昆虫细胞，收获培养上清，得到rS、rF和M基因的重组杆状病毒。具体的，所述制备方法，扩增所述IBVS1基因的引物为S1-F/S1-R，所述P1-F和P1-R的序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；扩增所述IBVS-TM/CT基因的引物为S-TM/CT-F和S-TM/CT-R，所述S-TM/CT-F和S-TM/CT-R的序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；扩增所述NDVFecto基因的引物为Fecto-F/Fecto-R，所述Fecto-F/Fecto-R的序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；扩增所述IBVM基因的引物为M-F/M-R，所述M-F/M-R的序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。具体的，所述制备方法，所述步骤(1)具体包括如下步骤：分别扩增IBVS1、IBVS-TM/CT、NDVFecto和IBVM基因，纯化，得到IBVS1、IBVS-TM/CT、NDVFecto和IBVM基因的纯化产物；所述步骤(2)具体包括如下步骤：分别对IBVS1、IBVS-TM/CT和NDVFecto的纯化产物进行酶切，得到IBVS1、IBVS-TM/CT和NDVFecto的酶切产物，将IBVS1和IBVS-TM/CT的酶切产物连接，得到rS基因，纯化，得到rS基因的纯化产物，将NDVFecto和IBVS-TM/CT的酶切产物连接，得到rF基因，纯化，得到rF基因的纯化产物；所述步骤(3)具体包括如下步骤：将所述rS、rF和IBVM基因的纯化产物分别进行分子克隆，提取质粒，得到分别包含rS、rF和M的克隆载体；分别对rS、rF和M的克隆载体进行酶切，同时对杆状病毒穿梭质粒进行酶切，得到rS基因、rF基因、M基因和杆状病毒穿梭质粒的酶切产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒由rS、rF和IBV M基因分别转入杆状病毒表达系统，再将分别包含rS、rF和M基因的杆状病毒表达系统转入昆虫细胞内组装而成，所述rS基因由IBV S1基因和IBV S‑TM/CT基因连接而成，所述rF基因由NDV Fecto基因和IBV S‑TM/CT基因连接而成。

【技术特征摘要】
1.一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒由rS、rF和IBVM基因分别转入杆状病毒表达系统，再将分别包含rS、rF和M基因的杆状病毒表达系统转入昆虫细胞内组装而成，所述rS基因由IBVS1基因和IBVS-TM/CT基因连接而成，所述rF基因由NDVFecto基因和IBVS-TM/CT基因连接而成。2.根据权利要求1所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述IBVS1基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBVS-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述IBVS1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述IBVS-TM/CT基因的序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述NDVFecto基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBVS-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述NDVFecto基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求3所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述IBVM基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4。5.根据权利要求4所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述杆状病毒表达系统中杆状病毒穿梭质粒为pFastbac系列载体，所述杆状病毒表达系统中感受态细胞为DH10Bac，所述昆虫细胞为Sf9。6.一种权利要求4或5所述的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)扩增IBVS1、IBVS-TM/CT、NDVFecto和IBVM基因；(2)连接IBVS1和IBVS-TM/CT，得到rS基因，连接NDVFecto和IBVS-TM/CT，得到rF基因；(3)将所述rS、rF和IBVM基因转入杆状病毒表达系统，得到分别包含述rS、rF和IBVM基因的重组杆状病毒表达系统；(4)将所述分别包含述rS、rF和IBVM基因的重组杆状病毒表达系统共转染入昆虫细胞，收获培养上清，得到rS、rF和M基因的重组杆状病毒。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中扩增所述IBVS1基因的引物为S1-F/S1-R，所述P1-F和P1-R的序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；扩增所述IBVS-TM/CT基因的引物为S-TM/CT-F和S-TM/CT-R，所述S-TM/CT-F和S-TM/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红宁，杨鑫，吴暄，左磊，袁齐武，李豪，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51