用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒，包括流动相A、流动相B，标准物储备液、同位素内标物储备液、样本萃取液和稀释液。流动相A为超纯水，流动相B为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，标准物储备液为20mg/mL的油酸溶液，同位素标记物储备液为20mg/mL的油酸‑[

【技术实现步骤摘要】
用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒及其制备方法和应用
：本专利技术属于生物检测领域，涉及一种检测试剂盒，具体来是一种用于检测血清或者血浆中油酸(Oleicacid,OA)浓度的试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
：油酸(Oleicacid,OA)是一种单不饱和Omega-9脂肪酸,分子式C18H34O2。人体血液内的油酸分为外源性油酸和内源性油酸，外源性油酸来源于饮食摄取，内源性油酸通过硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-coenzymeAdesaturase,SCD)催化饱和脂肪酸生成。油酸是游离脂肪酸(freefattyacid，FFA)中的主要成分，肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。正常情况下，FFA是三大能源物质，糖、蛋白质和脂肪代谢的重要一环，与非酒精性脂肪肝(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)、动脉粥样硬化和糖尿病等代谢性疾病的发生发展密切相关。研究发现在肝细胞中OA可通过干扰胰岛素受体底物磷酸化、激活磷脂酰肌醇3等，导致葡萄糖摄取或糖原合成下降，即产生肝细胞胰岛素抵抗。在动物实验中证实血浆脂肪酸短期升高能引起大鼠肝脏和外周胰岛素抵抗，其中以OA为代表的单不饱和脂肪酸，诱导肝胰岛素抵抗的作用显著强于多不饱和脂肪酸。几年来发表的相关学术论文中，多数以OA来诱导来制备肝细胞/大鼠胰岛素抵抗模型。胰岛素抵抗(InsulinResistance，IR)是指胰岛素靶组织，包括肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性降低，是多种代谢性疾病，包括血脂异常、高血压、中心性肥胖、2型糖尿病(Type2Diabetes,T2D)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)的共同病理生理基础。在我国及欧美NAFLD诊疗指南中均明确指出，NAFLD是一种与IR和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，除了心脑血管病、2型糖尿病，NAFLD也是2l世纪全球重要的公共健康问题之一，亦是我国愈来愈重视的慢性肝病问题。但遗憾的是NAFLD至今没有有效的实验室诊断指标。OA是体内甘油三酯水解产物，是诱导胰岛素抵抗、特别是肝胰岛素抵抗的重要因素，表明血浆/血清OA水平可能成为机体出现IR和/或NAFLD的早期预警、早期诊断的标志物。OA是一种单不饱和脂肪酸，常规方法难以定量检测。目前在国内外基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)定量检测OA的方法和试剂盒尚未见报道。
技术实现思路
：针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术用于检测血清或者血浆中OA浓度的试剂盒和方法，所述的这种用于检测血清或者血浆中OA浓度的试剂盒和方法要解决现有技术中检测血清或者血浆中OA浓度的方法复杂，准确性不高的技术问题。本专利技术提供了一种用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒，包括流动相A、流动相B、标准物储备液、同位素内标物储备液、样本萃取液和稀释液，所述的流动相A为超纯水，所述的流动相B为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的标准物储备液为20mg/mL的油酸溶液，所述的同位素内标物储备液为20mg/mL的OA-[13C5]溶液，所述的样本萃取液为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。本专利技术还提供了上述的一种检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)一个制备流动相A的步骤，将超纯水超声脱气备用；2)一个制备流动相B的步骤，将甲醇加入到乙腈中，甲醇和乙腈的体积比为1：1，混合均匀并超声脱气备用；3)一个制备标准物储备液的步骤，称取油酸标准品，用自动取样器加入甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，加入后油酸的浓度为20mg/mL，完全溶解后放置于-20℃冰箱中保存备用；4)一个制备同位素内标物储备液的步骤，称取OA-[13C5]加入到甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，加入后OA-[13C5]的浓度为20mg/mL，完全溶解后于-20℃冰箱中保存备用；5)一个制备样本萃取液的步骤，取甲醇和乙腈，按照体积比1:1组成溶液，混匀、备用；6)一个制备稀释液的步骤，称取牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白不含游离脂肪酸，将牛血清白蛋白加入到磷酸缓冲盐溶液中，使得牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。本专利技术还提供了采用上述的试剂盒检测血清或者血浆中OA浓度的方法，包括如下步骤：1)一个制备标准工作液和质控品的步骤；在稀释液中加入标准物储备液，稀释成10、25、50、100、500、1000μg/mL的标准工作液，另外配制成25、500μg/mL的溶液作为质控品。2)一个制备同位素内标物工作液的步骤，用样本萃取液将同位素内标物储备液稀释成100μg/mL的工作液，存放于4℃冰箱中备用。3)一个制备含有同位素内标物的样本萃取液步骤，取同位素内标工作液与样本萃取液按1:14的体积比混匀。4)一个制备样本的步骤，样本经室温平衡1小时后，使用0.22μm一次性滤器过滤，然后准确移取10μL过滤后的样本加入1.5mLEP管中，加入上述3)含同位素内标的样本萃取液100μL，涡旋振荡2min，以10000rpm的转速离心20分钟，转移上清液至液相色谱检测专用96孔板中。所有的标准曲线及质控品均按照样本处理。5)一个超高效液相色谱分析的步骤，色谱参数为：超纯水组成的流动相A；甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的流动相B溶液；梯度洗脱，B相起始为5％，流速为300μl/min，进样体积为5μl。OA及内标的保留时间均为3.11min，分析时间为12min。6)一个质谱分析步骤，质谱参数：自动进样器温度为4℃，柱温为40℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，OA和同位素内标OA-13C5检测的离子质荷比(m/z)为281.3/281.3、286.3/286.3。雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为450℃。去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-100V、-10V、-5V和-4500V。OA和OA-[13C5]碰撞能量为-30V。7)将步骤4)制备的标准品溶液依次从低浓度到高浓度进样，每个混合标准品溶液连续进样3次，采用步骤5)和步骤6)的液相色谱串联质谱的方法分析。以油酸与同位素内标OA-[13C5]浓度比为X轴，油酸与同位素内标的峰面积比为Y轴，进行线性回归，得到油酸的标准曲线。8)采用步骤5)和步骤6)的液相色谱串联质谱的方法分析步骤4)的待测样品和质控品，根据标准曲线计算样本浓度。本专利技术提供的试剂盒和色谱、质谱分析参数，测定血清或血浆中OA线性范围为10～1000μg/mL，批间精密度≤2.8％、批内CV≤3.5％。试剂盒4℃放置24h、五天和十天后，同一组样本OA的浓度与初始值比较，误差为0～5％，表明试剂盒和样品稳定性良好。经过初步临床检测分析，50例健康成人空腹血清OA参考范围为113.2±58μg/mL，100例NAFLD患者空腹血清水平分别为328.1±196.7μg/mL,66例单纯T2DM和43例T2DM合并NAFLD患者分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒，其特征在于：包括流动相A、流动相B、标准物储备液、同位素内标物储备液、样本萃取液和稀释液，所述的流动相A为超纯水，所述的流动相B为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的标准物储备液为20mg/mL的油酸溶液，所述的同位素内标物储备液为20mg/mL的OA‑[13C5]溶液，所述的样本萃取液为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒，其特征在于：包括流动相A、流动相B、标准物储备液、同位素内标物储备液、样本萃取液和稀释液，所述的流动相A为超纯水，所述的流动相B为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的标准物储备液为20mg/mL的油酸溶液，所述的同位素内标物储备液为20mg/mL的OA-[13C5]溶液，所述的样本萃取液为甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，所述的稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。2.权利要求1所述的一种检测血清或者血浆中油酸浓度的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)一个制备流动相A的步骤，将超纯水超声脱气备用；2)一个制备流动相B的步骤，将甲醇加入到乙腈中，甲醇和乙腈的体积比为1：1，混合均匀并超声脱气备用；3)一个制备标准物储备液的步骤，称取油酸标准品，用自动取样器加入甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，加入后油酸的浓度为20mg/mL，完全溶解后放置于-20℃冰箱中保存备用；4)一个制备同位素内标物储备液的步骤，称取OA-[13C5]加入到甲醇和乙腈按照体积比1:1组成的溶液，加入后OA-[13C5]的浓度为20mg/mL，完全溶解后于-20℃冰箱中保存备用；5)一个制备样本萃取液的步骤，取甲醇和乙腈，按照体积比1:1组成溶液，混匀、备用；6)一个制备稀释液的步骤，称取牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白不含游离脂肪酸，将牛血清白蛋白加入到磷酸缓冲盐溶液中，使得牛血清白蛋白的浓度为50mg/mL。3.采用权利要求1所述的试剂盒检测血清或者血浆中油酸浓度的方法，其特征在于包括如下步骤：1)一个制备标准工作液和质控品的步骤；在稀释液中加入标准物储备液，稀释成10、25、50、100、500、1000μg/mL的标准工作液作标准曲线，另外配制成25μg/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：范列英，金中淦，宗明，
申请(专利权)人：上海市东方医院，
类型：发明
国别省市：上海,31