玉米乳杆菌诱变菌及高产乳酸的用途制造技术

本发明专利技术提供一种诱变的玉米乳杆菌及其生物制剂，其中该诱变菌是KJY13(KJY‐HN001‐01‐03)，CGMCC NO.15423，保藏日期为2018年03月07日。本发明专利技术还提供该诱变菌所制备的生物制剂，用于高产乳酸的用途。本发明专利技术还提供该诱变菌单独或联合其他乳酸菌制备用于酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的凝固剂的用途。

Mutagenic Bacteria of Lactobacillus zeae and the Use of High-yielding Lactic Acid

The invention provides a mutagenic Lactobacillus zeae and its biological preparation, in which the mutagenic bacteria are KJY13 (KJY HN001 01 03), CGMCC NO. 15423 and the storage date is 07 March 2018. The invention also provides a biological preparation prepared by the mutagenic bacteria for the use of high-yield lactic acid. The invention also provides the use of the mutagenic bacteria to prepare coagulant for yoghurt, yoghurt tofu, soybean clear liquid beverage and soybean clear liquid soup separately or in combination with other lactic acid bacteria.

【技术实现步骤摘要】
玉米乳杆菌诱变菌及高产乳酸的用途
本专利技术属于生物制剂领域，具体是涉及一种诱变的玉米乳杆菌(Lactobacilluszeaestrain)，并通过该诱变菌来高产乳酸的用途。
技术介绍
发酵食品是指在食品加工过程中有微生物或酶参与而形成的一类特殊食品。在一般发酵中以乳酸菌为代表的有益微生物群体稳定且占绝对优势。乳酸菌在发酵过程中产生糖类和乳酸，促使发酵环境中的pH和Eh迅速降低，致病菌在酸性环境中的生长受到抑制。同时，乳酸菌释放的H2O2、细菌素、双乙酰、有机酸等多种代谢产物也可抑制有害菌的生长。具有优良性状的乳酸菌可以在食品业中作为发酵剂使用，也可在饲料制备中作为酸化剂使用，还可以制作成调节肠道的各种益生制剂为动物和人类的健康贡献力量。植物表面附着乳酸菌的种类和数量因自然条件，生长环境及种类的差异而不同。调查和分类鉴定不同样品的乳酸菌资源，建立微生物基因库，将大大提高乳酸菌的利用价值。目前国外研究者对饲料乳酸菌的分类鉴定及乳酸菌在各行业中的应用进行了深入全面的研究(夏姣等，“传统四川泡菜发酵过程中明串珠菌的分离鉴定，《食品工业科技》，2014；韩雪，“天然发酵青贮饲料中乳酸菌的分离与应用研究”，2013)。在我国，乳酸菌的鉴定分析及在各行业生产中的应用等还显得相对薄弱，迫切需要建立健全我国乳酸菌资源库，全方位开发利用国内乳酸菌资源。玉米乳杆菌(Lactobacilluszeaestrain)，从属于乳杆菌属，DOBSON等通过对干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及玉米乳杆菌16SrRNA及16S～23SITS进行测定，构建了系统发育树，并通过聚类分析、表型分析免疫印迹法试验等，建议将干酪乳杆菌和类干酪乳杆菌归为干酪乳杆菌种，不再单独命名类干酪乳杆菌。他们研究还发现，ATCC393在系统发育树和聚类分析中并没有和干酪乳杆菌分在一个组，而是和玉米乳杆菌分在了一个组，因此认为ATCC393不应为干酪乳杆菌的标准菌株，而是玉米乳杆菌。研究表明，玉米乳杆菌是人体正常菌群之一，肠道黏着率高，定植能力强，并具有高效降胆固醇，促进细胞分裂，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要的生理保健功能。玉米乳杆菌为革兰阳性厌氧菌，无质粒；不能利用乳糖，但可代谢单糖；在厌氧情况下能很好生长，在有CO2存在的情况下也能生长。玉米乳杆菌能够耐受动物消化道环境，在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素及提高机体免疫力等功效，并对于过敏体质有很好的缓解作用。玉米乳杆菌作为具有益生潜力的乳酸菌，在食品研发领域有着十分重要的用途。近年来，国内对玉米乳杆菌的研究主要集中在饲料和发酵食品中。例如，中国专利技术专利申请201610128283.7、“玉米乳杆菌LZ3及其在水产养殖中的应用”公开了一种生物保藏的玉米乳杆菌LZ3，其具有抑制嗜水气单胞菌生长或繁殖的能力。该菌作为嗜水气单胞菌拮抗菌可以制成抑菌制剂在水产养殖中进行应用，预防嗜水气单胞菌对水产养殖对象的危害；可作为益生菌制剂，改善养殖水质。然而，该专利技术只是研究如何通过玉米乳杆菌来降解水产养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐等有害物质，从而改善养殖水质，并不涉及通过提高乳酸产量以用于相关食品应用中。中国专利技术专利200610159700.0、“一种玉米青贮用乳酸菌剂及制作方法”公开了含有玉米乳杆菌的玉米青贮用乳酸菌剂，其具有加速玉米青贮成熟和提高玉米青贮品质的优点。虽然该专利技术能够利用原料中的碳水化合物进行乳酸发酵，使得青贮饲料中的乳酸含量达到1.5‐2.0％，但该专利技术需要复配坚强肠球菌，其研究在于通过乳酸发酵来如何降解青贮饲料中的纤维素，并不涉及通过提高乳酸产量以用于相关食品应用中。在研究用于食品领域生产乳酸的玉米乳杆菌在国内外的文献报道相对较少，其中大部分从泡菜等发酵食品中分离出来。李啸(“我国传统泡菜自然发酵与单菌发酵微生物及代谢特性研究”，南昌大学硕士研究生学位论文，2014)研究了自然发酵泡菜中优势微生物(乳酸菌、醋酸菌、酵母菌和霉菌)的消长规律和代谢物质的变化等，并认为发酵开始后，乳酸菌成为优势菌，并可抑制酵母菌和霉菌的生长直至消亡。四种乳酸菌中，肠膜明串珠菌在发酵前期启动泡菜发酵过程，并大量代谢产酸，而植物乳杆菌和玉米乳杆菌以及干酪乳杆菌是后期发酵酸化的主要力量，其中肠膜明串珠菌单菌发酵的终点pH值为3.50，其他三株乳酸杆菌单菌发酵的终点pH值为3.10‐3.20之间。可见，该报道初步报道了玉米乳杆菌可以作为产乳酸的有益菌，但其产酸能力低于植物乳杆菌和干酪乳杆菌。刘宗敏等(不同乳酸菌发酵萝卜干的品质动态变化研究，《食品工业科技》，2017年第38卷第9期)公开了在发酵萝卜中肠膜明串珠菌、玉米乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸乳球菌的产酸能力的分析。研究发现，在平稳期，培养肠膜明串珠菌、玉米乳杆菌、副干酪乳杆菌和乳酸乳球菌培养液的pH基本上维持在4.25、3.90、3.85和3.95，表明玉米乳杆菌的产酸能力并不突出，其结果只是与李啸的研究论文保持一致。此外，各组中，能够表征乳酸含量的总酸度56d后由大到小分别是：副干酪乳杆菌(1.41％)＞乳酸乳球菌(1.26％)＞自然发酵(1.20％)＞肠膜明串珠菌(1.046％)＞玉米乳杆菌(0.89％)。虽然总酸度越高并不代表发酵蔬菜品质越好，但该研究证明了玉米乳杆菌的产乳酸能力不足现有的乳酸菌，还有待提高。综上，目前需要一种能够高产乳酸的玉米乳杆菌，以便满足用于食品领域的简便、廉价和食品安全的生产需要。
技术实现思路
本专利技术原理在于，目前的高产乳酸的玉米乳杆菌的筛选，主要停留在传统的自然筛选或通过选择压能进行筛选。前者难以获得高产效率的菌株，而后者所获得的诱变菌，又由于选择压的消失而遗传性能不稳定，导致菌株退化。有鉴于此，本专利技术首次提供了通过复合诱变技术来筛选高产乳酸的玉米乳杆菌，同时通过多次重复的复筛，使得诱变菌株的性能稳定。因此，本专利技术第一目的提供一种通过复合诱变技术而获得的高产乳酸的玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)KJY13，保藏号为CGMCCNo.15423,保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)KJY11，保藏号为CGMCCNo.15421，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述植物乳杆菌诱变菌株(Lactobacillusplantarum)KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)KJY14，保藏号为CGMCCNo.15424，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)KJ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过复合诱变技术而获得的高产乳酸的玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423,保藏日期为2018年03月07日。保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一种通过复合诱变技术而获得的高产乳酸的玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCCNo.15423,保藏日期为2018年03月07日。保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.制备如权利要求1所述诱变菌株KJY13的方法，步骤包括：(1)将冻存的玉米乳杆菌株分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；(7)重复复合诱变：按照以上步骤(3)-(7)，再进行微波连续诱变2代-复筛-亚硝基胍连续诱变2代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；(8)选择生长形状最良好的多个单菌落进行豆清液培养基发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，通过酸碱滴定法或pH电位法测量上清液的酸度并计算乳酸产量，其中一个突变株发酵生产的乳酸产量为13.496g/L；(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为玉米乳杆菌KJY13，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15423。3.通过权利要求1所述的玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，或通过权利要求2的方法所制备的玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，来生产富含乳酸的食用溶液的方法，包括：(1)将保藏的玉米乳杆菌诱变菌株于MRS液体培养基中活化培养；(2)将活化的培养液，以108CFU(即个/ml)的浓度加入预先制备好的培养液中(豆浆、豆清液或米浆中)，于37℃下静置培养24-96h，获得终发酵液；(3)取部分发酵液离心过滤菌液后，获得无乳杆菌的上清液；(4)经过检测上清液，当酸度(或乳酸产量)达到13g/L以上时，所述终发酵液即为富含乳酸的食用溶液，其中所述食用溶液是用于制作泡菜、食用酸汤的溶液，和/或(5)将所有终发酵液进行离心，获得无乳杆菌的食用溶液。4.权利要求3所述的方法，其中所述无乳杆菌的食用溶液是用于制作酸奶、酸豆清液、食用酸汤的溶液。5.通过权利要求1所述的玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，或通过权利要求2的方法所制备的玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产富含...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胤，李肯，赵聃，
申请(专利权)人：湖南肯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43