一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法技术

一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法，包括藻种选择和更新纯化措施，两种培养液配制，以适合藻种在不同阶段和不同培养环境中生长需要，纯化措施包括藻种选取，培育筛选，先后经100ul单株培养到96孔板培养、24孔板中更新、再移到15ml试管内更新、再移到250ml三角瓶内更新，选藻种符合质量要求的按1∶2的比例不断的反复扩种，从中挑选质量好的移到1L的三角瓶的藻种按照1∶1的比例至5L的烧瓶中作藻种扩增；扩增的藻种通过显微镜镜检，状态好的藻种将按照1∶8的比例再次扩增；得到的藻种即作为化室外规模生产培养。每次更新用设备容量小、培养时间短、操作简单、避免雨生红球藻受菌污染及转移中成功率低等。

A method for regeneration and purification of Haematococcus pluvialis

A method of algae regeneration and purification for Haematococcus pluvialis is described, which includes algae selection and purification measures, two kinds of culture media preparation, in order to meet the growth needs of algae at different stages and in different culture environments. The purification measures include algae selection, cultivation and screening. The algae were cultured in 96-well plate culture by 100 UL single plant, renewed in 24-well plate, renewed in 15 ml test tube and then moved to 250 ml 3. The algae species are renewed in the horn flask, and the algae species which meet the quality requirement are continuously expanded in a ratio of 1:2. The algae species which have been moved to L flask with good quality are selected to amplify in a ratio of 1:1 to 5L flask. The algae species which are in good condition will be amplified again in a ratio of 1:8 by microscopic examination. The algae species obtained will be cultured in an outdoor scale. The equipment used for each renewal has the advantages of small capacity, short incubation time, simple operation, low success rate in avoiding bacterial contamination and transfer of Haematococcus pluvialis.

【技术实现步骤摘要】
一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法
本专利技术涉及一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法；属于微生物学在生物
的应用。
技术介绍
雨生红球藻又被叫做湖生红球藻或湖生血球藻，是一种普遍存在的绿藻，属于团藻目，红球藻科，是公认的自然界中生产天然虾青素的最好生物。虾青素是类胡萝卜素科的秦椒黄族中的一种。秦椒黄有助于防止维生素A、维生素E及其他的类胡萝卜素发生氧化，是所有类胡萝卜素中抗氧化效果最强的，比β-胡萝卜素强10倍，比维生素E强100倍。经营养学家证实，虾青素可以跨越从血液到大脑的屏障，所以虾青素对大脑、中枢神经系统及双眼都可起到保护作用。实验表明优良的雨生红球藻可以保持优良特性传代25代前均保持稳定性，以便有利于科研研究和扩增生产，实验人员根据生产需求规定藻种的传代次数为17代，如果在17代以后，原本优良的藻种仍可以持续的保持着稳定性法则，在保证保种的前提下亲本继续进行传代。当藻种稳定性减弱后，随着传代次数的增多主要会带来以下影响：1.原本抗性耐受性等性质均稳定的优质藻细胞稳定性衰退，最终影响科学研究和生产；2.相同时间内分裂能力减慢、细胞数目减少、藻种对数期缩短最终总产值减少；3.生长周期变长、适用周期变长不仅是生产研究时间增多，生产成本增加，同时细胞本身变性与外在污染的几率均增加；4.异型细胞增多、细胞直径缩小、细胞色素不均匀、色素含量降低等最终导致虾青素的含量降低；5.根据外界环境变化所挑选出来的具有特异性的藻细胞特异性衰退。
技术实现思路
本专利技术的目是提供一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法；以解决现有雨生红球藻的藻种培育技术中存在的上述问题。技术方案：一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法，包括藻种选择和更新纯化措施、培养液配制，具体如下：一、雨生红球藻的藻种更新纯化措施：1、从平板保存的藻种中挑选单个细胞增殖出来的单株细胞，保证后期培养是单种培养；2、平板挑选出来的单株细胞在96孔板中培养，培养量100ul，培养量小，有利于单株细胞快速增殖；3、96孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；4、96孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到24孔板中进一步更新，保证了细胞的生物活性和分裂能力；5、24孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；6、24孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到15ml试管内进一步更新，保证了细胞的生物活性和分裂能力；7、15ml试管中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；8、15ml试管中培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到250ml三角瓶内进一步更新，保证了细胞的生物活性和分裂能力；9、250ml三角瓶中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，将与之前保存的藻种，即平板上藻种、96孔板藻种、24孔板、15ml试管藻种同时对比，必须是各阶段生长状态均好的情况才可继续进行进一步的更新工作，否则将从头开始操作，保证藻种的活性、生长速率的稳定性；10、确定长势好的250ml藻种将按1∶2的比例不断的进行反复扩种，比较确保来源相同的两个250ml三角瓶内的藻液长势是否相同，选择相同时间内藻液生长速度最快、pH变化最小、OD值最大、色素最多的两瓶用于藻种继续培养；所述按1∶2即1个250ml三角瓶中藻种移入2个250ml三角瓶中扩种；11、取挑选出来的两瓶250ml进行藻种扩增，每次扩增保证9个250ml三角瓶的藻种和6个1L的三角瓶的藻种；12、9个250ml三角瓶的藻种反复循环使用，每次都挑选三个长势最好的用作藻种保存反复使用（正常使用20代左右），1L的三角瓶的藻种用于藻种扩增；13、1L的三角瓶的藻种按照1∶1的比例扩增至5L的烧瓶中进行藻种扩增；所述1∶1是1个1L三角瓶的藻种移到1个5L的烧瓶中扩种；14、5L的烧瓶藻种培养后通过显微镜镜检，状态好的藻种将按照1∶8的比例再次进行扩增；所述1∶8是指1个5L烧瓶中的藻种移入8个5L烧瓶中扩种；15、扩增后的藻种即可作为规模化室外生产培养用的藻种。二、上述藻种纯化措施中使用的培养液有两种，第一种是适合使用5L烧瓶内雨生红球藻的快速生长繁殖的培养液A，第二种是适合使用96孔板、24孔板、15ml试管、250ml三角瓶、1L三角瓶内雨生红球藻快速生长繁殖的培养液B。所述培养液A的配制方法，包括主料和辅料：1、以配制1升培养液计，主料成分：NaNO3（硝酸钠）0.2-0.4g/L,K2NO3（硝酸钾）0.1-0.3g/L,MgSO4*7H2O（七水硫酸镁）0.05-0.2g/L,柠檬酸0.1-0.3g/L,CaCl2*2H2O（二水氯化钙）0.02-0.08g/L,KH2PO4(磷酸二氢钾)0.01-0.03g/L,Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.001-0.003g/L,NaHCO3（碳酸氢钠）0.025-0.05g/L,Na2SO3(亚硫酸钠)0.02-0.05g/L,FeSO4*7H2O0.001-0.003g/L,FeCl3*6H2O(氯化铁)0.001-0.003g/L；2、辅料成分即微量元素：MnCl2*4H2O（四水氯化锰）0.00025-0.00045g/L，ZnCl2（氯化锌）0.00003-0.00006g/L，（NH4）6Mo7O24（钼酸铵）0.00002-0.00006g/L，CuSO4*5H2O（五水硫酸铜）0.00002-0.00005g/L，CoCl2*6H2O（氯化钴）0.00003-0.00006g/L。所述培养液B的配制方法包括主料和辅料：1、主料：NaNO3（硝酸钠）0.8-1.5g/L，K2HPO4（磷酸氢二钾）0.02-0.08g/L，MgSO4*7H2O（七水硫酸镁）0.05-0.08g/L，CaCl2*2H2O（二水氯化钙）0.02-0.04g/L，柠檬酸0.02-0.08g/L，柠檬酸铁铵0.02-0.08g/L，Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.001-0.003g/L，Na2CO3（碳酸钠）0.02-0.06g/L；2、辅料成分即微量元素：H3BO3（硼酸）0.002-0.003g/LMnCl2*4H2O（四水氯化锰）0.001-0.002g/L，ZnSO4*7H2O（七水硫酸锌）0.0002-0.0003g/L，Na2MoO4（钼酸钠）0.0003-0.0005g/L，CuSO4*5H2O（五水硫酸铜）0.00008-0.0001g/L，Co(NO3)2*6H2O（六水硝酸钴）0.00005-0.00008g/L。培养液、培养的工具、器皿作高温灭菌，灭菌条件为121℃，灭菌至少30min；接种、转接操作均在超净工作台上进行。本专利技术包括配制培养液以及雨生红球藻的藻种更新纯化方法，优点在于每次更新所用设备容量小、培养时间短、操作简单、避免了雨生红球藻受菌污染及转移过程中存在的成功概率以影响工作的问题，而且采用的是物理纯化的方法，避免了藻细胞采用化学纯化方法受化学药品的影响，导致细胞畸形、抗菌能力的抗性下降的问题，整体上可大大提高雨生红球藻的藻细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法，包括藻种选择和更新纯化措施，其特征在于具体步骤如下：一、雨生红球藻的藻种更新纯化措施：（1）从平板保存的藻种中挑选单个细胞增殖出来的单株细胞，保证后期培养是单种培养；（2）平板挑选出来的单株细胞在96孔板中培养，培养量100ul，培养量小，有利于单株细胞快速增殖；（3）96孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；（4）96孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到24孔板中进一步更新；（5）24孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；（6）24孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到15ml试管内进一步更新；（7）15ml试管中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；（8）15ml试管中培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到250ml三角瓶内进一步更新；（9）50ml三角瓶中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，将与之前保存的藻种，即平板上藻种、96孔板藻种、24孔板、15ml试管藻种同时对比，必须是各阶段生长状态均好的情况才可继续进行进一步的更新工作，否则将从头开始操作，以保证藻种的活性、生长速率的稳定性；（10）确定长势好的250ml藻种将按1∶2的比例不断的进行反复扩种，比较来源相同的两个250ml三角瓶内的藻液长势是否相同，选择相同时间内藻液生长速度最快、pH变化最小、OD值最大、色素最多的两瓶用于藻种继续培养；所述按1∶2即1 个250ml三角瓶中藻种移入2个250ml三角瓶中扩种；（11）用挑选出来的两瓶250ml进行藻种扩增，每次扩增保证9个250ml三角瓶的藻种和6个1L的三角瓶的藻种；（12）9个250ml三角瓶的藻种反复循环使用，每次都挑选三个长势最好的用作藻种保存反复使用，1L的三角瓶的藻种用于藻种扩增；（13）1L的三角瓶的藻种按照1∶1的比例扩增至5L的烧瓶中进行藻种扩增；（14）5L的烧瓶藻种培养后通过显微镜镜检，状态好的藻种将按照1∶8的比例再次进行扩增；（15）扩增后的藻种即可作为规模化室外生产培养用的藻种。...

【技术特征摘要】
1.一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法，包括藻种选择和更新纯化措施，其特征在于具体步骤如下：一、雨生红球藻的藻种更新纯化措施：（1）从平板保存的藻种中挑选单个细胞增殖出来的单株细胞，保证后期培养是单种培养；（2）平板挑选出来的单株细胞在96孔板中培养，培养量100ul，培养量小，有利于单株细胞快速增殖；（3）96孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；（4）96孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到24孔板中进一步更新；（5）24孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；（6）24孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到15ml试管内进一步更新；（7）15ml试管中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；（8）15ml试管中培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到250ml三角瓶内进一步更新；（9）50ml三角瓶中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，将与之前保存的藻种，即平板上藻种、96孔板藻种、24孔板、15ml试管藻种同时对比，必须是各阶段生长状态均好的情况才可继续进行进一步的更新工作，否则将从头开始操作，以保证藻种的活性、生长速率的稳定性；（10）确定长势好的250ml藻种将按1∶2的比例不断的进行反复扩种，比较来源相同的两个250ml三角瓶内的藻液长势是否相同，选择相同时间内藻液生长速度最快、pH变化最小、OD值最大、色素最多的两瓶用于藻种继续培养；所述按1∶2即1个250ml三角瓶中藻种移入2个250ml三角瓶中扩种；（11）用挑选出来的两瓶250ml进行藻种扩增，每次扩增保证9个250ml三角瓶的藻种和6个1L的三角瓶的藻种；（12）9个250ml三角瓶的藻种反复循环使用，每次都挑选三个长势最好的用作藻种保存反复使用，1L的三角瓶的藻种用于藻种扩增；（13）1L的三角瓶的藻种按照1∶1的比例扩增至5L的烧瓶中进行藻种扩增；（14）5L的烧瓶藻种培养后通过显微镜镜检，状态好的藻种将按照1∶8的比例再次进行扩增；（15）扩增后的藻种即可作为规模化室外生产培养用的藻种。2.一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法使用的培养液，其特征在于上述藻种纯化措施中使用的培养液有两种，第一种是适合使用5L烧瓶内雨生红球藻的快速生长繁殖的培养液A，第二种是适合使用96孔板、24孔板、15ml试管、250ml三角瓶、1L三角瓶内雨生红球藻快速生长繁殖的培养液B；所述培养液A的配制方法，包括主料和...

【专利技术属性】
技术研发人员：李路荣，徐蕾，仲林强，柏老六，
申请(专利权)人：云南博欣生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53