一种雨生红球藻中与虾青素积累相关基因及其筛选的方法，所述基因为HpHDR，其序列长1421bp，基因序列见SEQ NO.1，所述基因HpHDR编码的HpHDR蛋白，其由434个氨基酸残基组成，分子式为C2129H3363N601O656S24，分子量大约为48.64KD，理论等电点为6.53，所述蛋白的空间结构具有15个α‑螺旋结构和12个β‑折叠结构，氨基酸序列见SEQ NO.2。本发明专利技术还提供一种所述基因HpHDR的筛选方法，所述筛选方法灵敏度高，检测数量多，筛选速度快，操作简单。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体地涉雨生红球藻中与虾青素积累相关基因及其筛选的方法。
技术介绍
虾青素是一种氧化型类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性，并且能够显著提高动物的免疫能力，能起到预防癌症的作用。目前虾青素主要用作鱼类和虾蟹等甲壳类动物及家禽的饲料添加剂。此外，天然虾青素已被批准为安全的人类食品添加剂，以用于食品的着色、保鲜及营养。雨生红球藻是一种单细胞绿藻，在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素，其积累量最高可达细胞干重的4％，从而成为目前最理想的天然虾青素合成工具。雨生红球藻中虾青素的合成和积累总是发生在不适于藻细胞生物量积累的逆境胁迫条件下，因此虾青素积累与藻细胞生物量积累之间的矛盾已经成为利用雨生红球藻高效生产虾青素的限制因素。虽然各国研究者通过摸索雨生红球藻培养条件、优化虾青素的提取条件来提高天然的虾青素的产量。但是这些研究从生理环境上或通过一定的理化处理来协调虾青素积累与生物量积累之间的矛盾，并没有从根本上解决这一矛盾，主要原因是对雨生红球藻这一生理过程中细胞内发生的分子调控机制未知。目前一些科学家对于红球藻胁迫条件下积累虾青素，抵御胁迫环境的机制也进行了一些探索研究。一些研究结果提示在虾青素积累过程中存在着复杂的调控网络，所以仅仅研究几个基因很难从全局上了解细胞的分子调控机制。要揭示雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素的分子调控机制还需要进行更多的研究。雨生红球藻在胁迫条件下的防御过程是发生在虾青素积累和形态上发生可视变化之前，因此雨生红球藻在变成红细胞之前，细胞内的转录组已经发生变化；并且以前也有研究证明虾青素合成酶基因的调控是发生在转录水平上。目前传统克隆相关基因的方法，在没有基因序列的前提下，大多是根据其他物种的同源基因设计兼并引物，这种方法的缺点是非特异性高，不容易成功，而且一次只能进行少量基因操作。因此，想要揭示雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素的分子机理，快速的筛选诱导条件下参与雨生红球藻积累虾青素的基因，了解这些基因的功能显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种雨生红球藻中与虾青素积累相关基因及其筛选的方法，本专利技术筛选方法灵敏度高，检测数量多，筛选速度快，操作简单。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案予以实现：一种雨生红球藻中与虾青素积累相关基因HpHDR，序列长1421bp，基因序列见SEQ NO.1。一种HpHDR蛋白，由434个氨基酸残基组成，分子式为C2129H3363N601O656S24，分子量大约为48.64KD，理论等电点为6.53，所述蛋白的空间结构具有15个α-螺旋结构和12个β-折叠结构，氨基酸序列见SEQ NO.2。本专利技术还提供一种所述基因的筛选方法，具体步骤如下：1)雨生红球藻的培养与诱导取对数生长期的雨生红球藻在缺N培养基中培养，并用光强200μmol photon/m-2s-1连续光照，取诱导24h后的雨生红球藻，用液氮速冻，以备用；2)cDNA文库的构建用Trizol方法提取步骤1)收集的诱导24小时后和正常培养的雨生红球藻的总RNA，并对RNA进行定量；分离miRNA，进行反转录得到cDNA，构建诱导后和正常培养的两个雨生红球藻cDNA文库；3)深度测序采用第二代测序技术Solexa对步骤2)所述的两个cDNA文库进行深度测序；4)测序分析利用生物信息学对步骤3)测的数据进行分析，分析2个表达谱的差异；采用了IDEG6来识别两个转录组中显著性差异的基因，显著性差异主要是以两个库中reads的丰度的差异性来确定，从而获得诱导条件下的差异基因；5)差异基因的生物信息学分析通过Blastn、Blastp程序在GenBank数据库中同源搜索，对步骤4)中得到差异基因进行功能推测，并进行KEGG、COG功能聚类分析，推测它们参与的代谢过程；6)差异基因的克隆及表达模式的研究根据步骤5)中分析和步骤3)获得的序列，通过RACE方法获得差异基因的全长，对雨生红球藻细胞设置不同诱导条件，用qRT-PCR定量检测差异基因在不同诱导条件下的转录情况，推测它们在代谢途径中的功能。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术方法通过缺氮诱导结合高光诱导，能使雨生红球藻中的虾青素在短时间内迅速积累，达到差异基因分析需要，缩短试验时间，同时本专利技术方法运用高通量测序技术，可以短时间内获得数量巨多的差异表达的基因，缩短研究周期，加快研究进程。本专利技术方法将实验与生物信息学分析相结合，加上运用定量PCR进行验证，可高效筛选出虾青素积累相关的基因，大大提高了筛选效率，为研究雨生红球藻在胁迫条件下积累虾青素的分子机制提供新思路和方法。附图说明图1:雨生红球藻诱导积累虾青素：a、空白对照；b、诱导12小时；c、诱导24小时；d、诱导36小时；e、诱导48小时；f、诱导64小时；g、诱导72小时。图2：总RNA库的琼脂糖凝胶电泳检测：1、marker，2、空白组细胞提取的RNA，3、是诱导组细胞提取的RNA；图3：生物信息学分析路线图；图4：测序得到的序列数据；图5：对雨生红球藻两个转录组中Unigens的数量进行比较；图6:差异基因的GO分析；图7：预测的HDR蛋白质三维结构；图8：雨生红球藻HpHDR推导的氨基酸序列与其它物种HDR同源性比较。*为保守的半胱氨酸位点：Ch-Vc-HDR：团藻HDR，XP_002947297.1；Ch-Cr-HDR：莱茵衣藻HDR，XP_001701302.1；Ch-Ds-HDR：杜氏盐藻HDR，ACM79143.1；Ch-Cv-HDR：小球藻HDR，XP_005848540.1；Ch-Ms-HDR：细小微胞藻HDR，ACI45954.1；Eu-Pt-HDR：杨树HDR，XP_002313816.1；Eu-Pd-HDR：赤松HDR，ACC54561.1；Eu-Gm-HDR：大豆HDR，XP_003541082.2；Eu-At-HDR：拟南芥HDR，NP_567965.1；Eu-Os-HDR：水稻HDREEC76125.1，；Cy-Sy-HDR：聚球藻HDRWP_015125553.1，；Cy-Ph-HDR：原緑丝藻HDR，WP_017712910.1；Cy-Sm-HDR：米氏伪枝藻HDR，WP_039717069.1；Cy-Cw-HDR：单细胞集胞藻HDR，WP_007309931.1；Cy-Ct-HDR：拟色球藻HDR，WP_041462512.1；图9：荧光定量PCR检测雨生红球藻中HDR基因在缺氮、高光和高光缺氮条件下的表达。具体实施方式实施例1缺N培养基在配制过程中比正常培养基缺少N源。取对数生长期的雨生红球藻收集后在缺N元素的MCM培养基中培养，并用光强200μmol photon/m-2s-1连续光照。并分别取诱导后0h、12h、24h、36h、48h、64h、72h的雨生红球藻进行细胞显微镜观察，并收集雨生红球藻，用液氮速冻，以备用。结果发现N饥饿加上强光可以很好的诱导的雨生红球藻进行虾青素的积累。图1为分别在诱导0小时、12小时、24小时、36小时、48小时、64小时、72小时的雨生红球藻细胞镜检结果。从结果中可以看出细胞在诱导12小时时，与空白对照组相近，没有什么变化。但是在诱导24本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种雨生红球藻中与虾青素积累相关基因HpHDR，其特征在于所述基因HpHDR的序列长1421bp，基因序列见SEQ NO.1。
【技术特征摘要】
1.一种雨生红球藻中与虾青素积累相关基因HpHDR，其特征在于所述基因HpHDR的序列长1421bp，基因序列见SEQ NO.1。2.一种权利要求1所述基因HpHDR编码的HpHDR蛋白，其特征在于所述HpHDR蛋白由434个氨基酸残基组成，分子式为C2129H3363N601O656S24，分子量大约为48.64KD，理论等电点为6.53，所述HpHDR蛋白的空间结构具有15个α-螺旋结构和12个β-折叠结构，氨基酸序列见SEQ NO.2。3.权利要求1所述基因HpHDR的筛选方法，具体步骤如下：1)雨生红球藻的培养与诱导取对数生长期的雨生红球藻在缺N培养基中培养，并用光强200μmolphoton/m-2s-1连续光照，取诱导24h后的雨生红球藻，用液氮速冻，以备用；2)cDNA文库的构建用Trizol方法提取步骤1)收集的诱导24小时后和正常培养的雨生红球藻的总RNA，并对RNA进行定量；分离m...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁成伟，叶乃好，张晓雯，石蕾，
申请(专利权)人：青岛科技大学，中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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