一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法技术

本发明专利技术涉及一种获得单倍体植株的方法，尤其是涉及一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，该方法为将黑果枸杞花蕾依次通过接种、生根培养、增殖培养、移栽和染色体鉴定，最后将所得单倍体进行加倍，并对所得的单倍体和多倍体再生苗进行大田移植，分别获得综合经济性状优良的纯系或进行杂交组合，进一步优选新的杂交品种，用于商品化生产即可；本发明专利技术方法独特、能大大缩短了育种周期、为新品种选育开辟新的途径、同时也为全基因组测序、绘制枸杞高密度遗传图谱、枸杞种质资源的遗传多样性分析奠定基础。

A method for obtaining haploid plants from anther culture of Lycium barbarum L.

The invention relates to a method for obtaining haploid plants, in particular to a method for obtaining haploid plants by anther culture of Lycium barbarum. The method is that the flower buds of Lycium barbarum are successively inoculated, rooted, multiplied, transplanted and identified by chromosome, and finally the obtained haploid is doubled, and the obtained haploid and polyploid regenerated seedlings are transplanted in the field. Pure lines with good comprehensive economic characteristics or hybrid combinations are obtained respectively, and new hybrid varieties are further optimized for commercial production; the method of the present invention is unique, can greatly shorten the breeding cycle, open up a new way for breeding new varieties, and also lay a foundation for genome sequencing, drawing high density genetic map of Lycium barbarum and genetic diversity analysis of Lycium barbarum germplasm resources. Basics.

【技术实现步骤摘要】
一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法
本专利技术涉及一种获得单倍体植株的方法，尤其是涉及一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法。
技术介绍
单倍体植物是进行植物遗传分析及开展育种工作的理想材料，已经在多个研究领域得以成功应用。然而自然产生单倍体的频率仅为0.001％～0.01％，难以应用于育种实践中，因此催生了植物学家对人工诱导单倍体的研究，其中应用最广、最高效的诱导方法为花药离体培养。花药培养是在适宜条件下花药离体培养诱导成单倍体植株的组织培养技术，是在单细胞水平上获得纯系的有效方法。在育种应用中常由单倍体植株染色体加倍获得育性恢复纯合二倍体植株(DH系)，DH植株也是分子定位和遗传图谱绘制的好材料。黑果枸杞(ruthenicumMurr.)系茄科(Solanaceae)、茄族(SolaneaeReichb.)、枸杞亚族(LyciinaeWettst.)、枸杞属(LyciumL.)，果实成熟后紫黑色。黑果枸杞富含天然活性成分花色苷，其成熟浆果中富含花色苷等活性物质，远远高于其他有色果实，其功效作用及营养价值，特别是其抗氧化及防治心脑血管疾病的功效，已被社会公众广泛认同和接受，是近年来枸杞育种及药效研究领域的热点之一。黑果枸杞高度杂合、遗传背景复杂、纯系构建困难。中国专利CN104273034A、CN106561448A、CN107135950A、CN107926711A、公开了获得黑果枸杞愈伤组织及再生植株的方法，此方法是利用黑果枸杞的枝条、叶片、种子诱导愈伤组织获得再生植株，但是育种周期长。目前还没有育种周期短，利用黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种方法独特、能大大缩短了育种周期、为新品种选育开辟新的途径、同时也为全基因组测序、绘制枸杞高密度遗传图谱、枸杞种质资源的遗传多样性分析奠定基础的一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法。本专利技术通过如下方式实现：一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：该方法为将黑果枸杞花蕾依次通过接种、生根培养、增殖培养、移栽和染色体鉴定，最后将所得单倍体进行加倍，并对所得的单倍体和多倍体再生苗进行大田移植，分别获得综合经济性状优良的纯系或进行杂交组合，进一步优选新的杂交品种，用于商品化生产即可；在所述接种前先进行取材，取材的方法为：在5月上旬至下旬，植株盛花前期和盛花期早晨7点-9点，采集H5、H10、H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾，然后进行花蕾消毒；所述花蕾消毒为在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次；所述接种为无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到胚状体诱导分化培养基上，放置在温度25-28℃，光照强度2000-2500LX，光照时间12h.d-1培养室中培养，花药接种20天后，有不同形状的胚状体出现；所述生根培养为在胚状体出现后转接到生根培养基上，生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA；所述增殖培养为在生根培养基上胚状体生长到2-5厘米时，一部分芽切割转接到增殖培养基中扩繁，一部分芽切割再转接到生根培养基上生根后用于移栽，每25d继代一次，增殖培养培养基为：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；所述移栽：首先营养土准备，然后用50％甲霜灵可湿性粉剂800倍、40％的乐斯本乳油800倍对营养土、育苗基质进行杀菌、杀虫，喷施后用塑料薄膜覆盖24小时后使用，营养钵下部装2/3营养土，上部装1/3育苗基质，用于移栽单倍体再生苗，最后进行炼苗移栽，炼苗移栽是将根系发育良好的单倍体再生苗移出培养室，揭去封口膜，置于移栽温室中炼苗48h，然后取出单倍体再生苗，洗净根系上附着的培养基，移栽到营养钵中，温室内温度保持在20～35℃，湿度保持在85～90％，晴天加盖遮荫网，阴天去掉遮荫网，一星期后逐日加大通风量，之后按照嫩枝扦插管理方法进行管理；所述染色体鉴定：采用根尖染色体计数直接鉴定法，在显微镜下观察统计根尖细胞中期染色体，当染色体数为12条时，为单倍体；所述营养土是壤土、沙子、腐熟有机肥按7：1：2质量比混合而成；所述胚状体诱导分化培养基配方为：MS+1.0～1.5mg/L6-BA+0.1～0.2mg/LNAA。本专利技术具有如下效果：1)方法独特：本专利技术提供的方法为将黑果枸杞花蕾依次通过接种、生根培养、增殖培养、移栽和染色体鉴定，筛选出单倍体植株，经染色体加倍后获得纯合二倍体种质，这种方法一代就可纯合，而常规育种获得纯合二倍体非常困难。2)取材方式独特：本专利技术提供取材的方法为：在5月上旬至下旬，植株盛花前期和盛花期早晨7点-9点，采集H5、H10、H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾，然后进行花蕾消毒；所述花蕾消毒：在超净工作台上，用75％乙醇溶液浸泡30s，0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次；3)胚状体诱导率高：本专利技术提供接种的方法：无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到胚状体诱导分化培养基上，放置在温度25-28℃，光照强度2000-2500LX，光照时间12h.d-1培养室中培养。胚状体诱导分化培养基配方为：MS+1.0～1.5mg/L6-BA+0.1～0.2mg/LNAA。花药接种20天后，有不同形状的胚状体出现，胚状体诱导率达到3.0％。4)生根和增殖培养方式独特：本专利技术提供的方法生根培养为胚状体出现后转接到生根培养基上，生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA；增殖培养：在生根培养基上胚状体生长到2-5厘米时，一部分芽切割转接到增殖培养基中扩繁，一部分芽切割再转接到生根培养基上生根后用于移栽。每25d继代一次，增殖培养培养基为：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。5)染色体的鉴定方法独特：本专利技术提供的染色体鉴定方法为采用根尖染色体计数直接鉴定法，在显微镜下观察统计根尖细胞中期染色体，当染色体数为12条时，为单倍体，所得单倍体分化率为1.5％-4.0％。6)本专利技术利用黑果枸杞花药培养技术，获得了单倍体、纯合二倍体、多倍体再生植株，并对所得的再生苗进行大田移植，获取了优良的黑果枸杞种质资源。7)本专利技术提供了一种黑果枸杞花药培养技术，利用黑果枸杞花药培养获得了单倍体再生植株，为枸杞全基因组测序，绘制枸杞高密度遗传图谱及枸杞种质资源的遗传多样性分析奠定基础，为新品种选育提供优系杂交材料和技术支撑。具体实施方式实施例：一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，本专利技术以黑果枸杞花蕾为材料，该方法如下：(1)取材：在5月上旬至下旬，植株盛花前期和盛花期早晨7点-9点，采集H5、H10、H古树的花蕾，醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾；(2)花蕾消毒：在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次；(3)接种：无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到胚状体诱导分化培养基上，放置在温度25-28℃，光照强度2000-2500LX，光照时间12h.d-1培养室中培养，胚状体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：该方法为将黑果枸杞花蕾依次通过接种、生根培养、增殖培养、移栽和染色体鉴定，最后将所得单倍体进行加倍，并对所得的单倍体和多倍体再生苗进行大田移植，分别获得综合经济性状优良的纯系或进行杂交组合，进一步优选新的杂交品种，用于商品化生产即可。

【技术特征摘要】
1.一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：该方法为将黑果枸杞花蕾依次通过接种、生根培养、增殖培养、移栽和染色体鉴定，最后将所得单倍体进行加倍，并对所得的单倍体和多倍体再生苗进行大田移植，分别获得综合经济性状优良的纯系或进行杂交组合，进一步优选新的杂交品种，用于商品化生产即可。2.如权利要求1所述的一种黑果枸杞花药通过培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：在所述接种前先进行取材，取材的方法为：在5月上旬至下旬，植株盛花前期和盛花期早晨7点-9点，采集H5、H10、H古树的花蕾，用醋酸洋红压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期的花蕾，然后进行花蕾消毒。3.如权利要求2所述的一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：所述花蕾消毒为在超净工作台上，先用75％乙醇溶液浸泡30s，再用0.1％氯化汞溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗3-4次。4.如权利要求1所述的一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：所述接种为无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离取出，接种到胚状体诱导分化培养基上，放置在温度25-28℃，光照强度2000-2500LX，光照时间12h.d-1培养室中培养，花药接种20天后，有不同形状的胚状体出现。5.如权利要求1所述的一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：所述生根培养为在胚状体出现后转接到生根培养基上，生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LNAA。6.如权利要求1所述的一种黑果枸杞花药培养获得单倍体植株的方法，其特征在于：所述增殖培养为在...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗青，张波，曹有龙，闫亚梅，戴国礼，焦恩宁，赵建华，尹跃，安巍，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：宁夏,64