针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法技术

本发明专利技术公开了针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，包括制备条件、制备装置、各种试剂的配制和超薄切片制备方法。所述针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法的整个流程是：首先将植物叶片在戊二醛的浸渍液中渗透，再用锇酸固定，乙醇脱水，Epon 812浸透、包埋，修块，超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，最后进行镜检。本发明专利技术解决了在对海南橡胶树叶片用禾本科等类型植物的传统超薄切片制备方法时，出现的在透射电镜制样过程中细胞组织结构不清晰，切片遇水碎裂，包埋剂与组织分离，包埋剂容易受潮等问题，有效缩短了实验操作时间，为橡胶树叶片的超微结构的研究提供了一种有效的技术方法。

【技术实现步骤摘要】
针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法
本专利技术涉及橡胶树叶片组织的显微形态学领域，具体是针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法。
技术介绍
透射式电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)是通过电子枪发出高速电子束经聚光镜均匀照射到样品上，入射电子与样品会发生碰撞与非弹性碰撞，形成弹性散射电子、损失电子和吸收电子，之后产生的光波再发生干涉和衍射作用，使均匀的入射电子束与样品作用后变得不均匀，再依次经过物镜、中间镜和投影镜放大后在荧光屏上或胶片上呈现出图像，反映出样品信息，它是观察和研究物质亚显微结构或超微结构等微观结构的重要工具。透射电镜技术最早应用于医学方面，主要观察一些病理切片，从而进行病理变化分析。随着现代科技水平的日新月异，透射电镜技术也在不断改进，使得它在物理材料学、植物生物细胞学都有广泛的应用，例如用透射电镜观察新型纳米材料的微观结构和观察植物的生长发育机理，遗传进化等方面。但目前尚无公开文献报道透射电镜技术在橡胶树叶片超微结构研究方面有成功应用，这与传统超薄切片的制备方法不适用橡胶树叶片密切有关。巴西橡胶树原产于巴西亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，包括制备条件、制备装置、各种试剂的配制和超薄切片制备方法(其中包括用于观察橡胶树叶片组织的超薄切片的染色方法)，其特征在于：所述制备条件和制备装置包括调控实验室温度为22℃～30℃，湿度≤45％；调控摇床温度为22℃～30℃，湿度≤40％，混匀包埋剂的转速为200rpm/min，渗透转速为100rpm/min；所述烘箱温度30℃～60℃，冰箱温度4℃，超薄切片机、真空泵和干燥器放置在室温下备用；所述各种试剂的配制：(1)A液0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液配制：Na2HPO4·2H2O 35.61g加蒸馏水溶解至1000ml；B液0.2mol/L的...

【技术特征摘要】
1.针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，包括制备条件、制备装置、各种试剂的配制和超薄切片制备方法(其中包括用于观察橡胶树叶片组织的超薄切片的染色方法)，其特征在于：所述制备条件和制备装置包括调控实验室温度为22℃～30℃，湿度≤45％；调控摇床温度为22℃～30℃，湿度≤40％，混匀包埋剂的转速为200rpm/min，渗透转速为100rpm/min；所述烘箱温度30℃～60℃，冰箱温度4℃，超薄切片机、真空泵和干燥器放置在室温下备用；所述各种试剂的配制：(1)A液0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液配制：Na2HPO4·2H2O35.61g加蒸馏水溶解至1000ml；B液0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液配制：Na2HPO4·2H2O31.21g加蒸馏水溶解至1000ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)100ml：所需缓冲液(PBS)的pH值6.8；A液(ml)24.5ml；B液(ml)25.5ml；蒸馏水(ml)50ml；(3)4％戊二醛、1％锇酸固定液：用0.1mol/LPBS提前两天配制配制，在0℃～4℃条件下保存，其中4％戊二醛和1％锇酸固定液，在每个2ml离心管放入大约1.2ml的固定；(4)饱和醋酸双氧铀染液的配制：取醋酸双氧铀1g，加蒸馏水至100ml。(5)柠檬酸铅染液的配制：硝酸铅1.33g；柠檬酸钠1.76g；蒸馏水30ml；用力震荡30min，使生成乳白色柠檬酸铅悬液(牛奶状)，随后加入0.1mol/LNaOH溶液直至溶液变透明，最终加入蒸馏水定容至50ml。(6)Epon812包埋剂的配制：按体积计13mlEpon812、5mlDDSA逐样加入容量瓶中，放置于摇床中充分混匀30min；再加入10mlNMA，放置于调控摇床中充分混匀30min；最后600ulDMP-30逐样加入容量瓶中，放置于调控摇床中充分混匀30min，待气泡排出，parafilm封口膜封闭，4℃冰箱真空干燥备用。其中：调控摇床温度为22℃～30℃；湿度≤40％；混匀包埋剂的转速为200rpm/min；Epon812为环氧树脂；DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐；NMA为甲基纳迪克酸酐；DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚。所述超薄切片制备方法：(1)取材：植物叶片取回后，将叶片切成1mm×2mm的长条样品叶片，取10-15个修好的样品叶片迅速放入装有1.5ml4％戊二醛固定液的离心管中，用真空泵抽气约15min，抽去样品叶片组织内部的气体，使样品叶片完全沉入固定液中；(2)前固定和漂洗：抽气后的样品叶片从抽气瓶中取出，迅速放入新鲜的4％戊二醛固定液中，0℃～4℃固定过夜，把经过前固定的样品叶片取出，在4℃条件下，用0.1mol/L的PBS进行漂洗，每次10min，连续漂洗5次，完全洗去样品叶片表面的戊二醛，此上更换试剂操作在冰上，随后放入4℃冰箱中；(3)后固定和漂洗：漂洗后的样品叶片放入1％的锇酸溶液中，parafilm封口膜封闭后，在4℃条件下固定5小时；用0.1mol/L的PBS进行漂洗，每次10min，连续漂洗5次；(4)脱水：将样品叶片用从低浓度的脱水剂逐步到高浓度的脱水剂进行脱水。即用30％无水乙醇，10min；用50％无水乙醇，10min；用70％无水乙醇，10min；用80％无水乙醇，10min；用90％无水乙醇，10min；用100％无水乙醇，10min，2次，用1/2无水乙醇+1/2丙酮，10...

【专利技术属性】
技术研发人员：高新生，胡欣欣，李维国，黄肖，谭海燕，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46