与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病相关GPR56及其应用制造技术

本发明专利技术公开了GPR56作为标志物在制备检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用。本发明专利技术通过转录组测序技术筛选到I型神经纤维瘤合并脊柱畸形相关标记物GPR56，进而探明了GPR56在I型神经纤维瘤合并脊柱畸形骨愈合缺陷发生发展中的作用，以及其发挥的作用机制，GPR56作为NF1合并脊柱畸形新型生物标志物，为指导其临床早期干预及靶向治疗提供了重要理论依据。

【技术实现步骤摘要】
与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病相关GPR56及其应用
本专利技术涉及生物技术和医学检测
，具体涉及与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病相关GPR56及其应用。
技术介绍
I型神经纤维瘤病(Neurofibromatosistype1，NF1)是一种较为常见的常染色体显性遗传病；不分性别或种族，则全球的发病率1/3000。1882年FrederichvonRecklinghausen首次描述了NF1，1987年NIH发表了正式的诊断标准。遗传学研究发现，I型神经纤维瘤病是由NF1肿瘤抑制基因的突变所致。NF1基因位于第17染色体长臂17q11.2，编码分子量为220kDa的胞浆蛋白——神经纤维素蛋白(neurofibromin)，该蛋白的部分作用为负向调控Ras原癌基因，而Ras是调控细胞生长的重要信号分子。基因突变的患者，体内每个细胞都含有一个突变无功能的NF1拷贝和一个功能正常的NF1拷贝。NF1型患者易发生中枢和周围神经系统的良、恶性肿瘤，以及其它部位的恶性病变。与NF1相关的肿瘤常见的包括：视觉通路的神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、恶性周围神经鞘瘤、胃肠道间质瘤、乳腺癌、白血病、嗜铬细胞瘤、十二指肠类癌瘤和横纹肌肉瘤。尽管此病的许多临床特征从患者出生后就很明显，但形成肿瘤却需要某些细胞获得性NF1变异，完全丧失基因功能。约有50％的NF1患者并无家族史，此病为自发性基因突变。随着基因检测技术的发展，基因型-表现型的关系已经大量被研究。譬如，NF1基因微缺失的患者表现型更为严重，易在早年就出现神经纤维瘤、平均IQ较低、面部特征异常、发生恶性周围神经鞘瘤的风险增加。先天性脊柱侧凸(Congenitalscoliosis，CS)是一种常见的脊椎疾病，新生儿患病几率为0.5-1‰。CS的临床表现为脊柱侧弯超过10度，这是由于胚胎的发育过程中脊柱畸形(半椎体畸形、分节障碍、蝴蝶椎、并肋等)引起的脊柱纵向生长不平衡导致的。CS可以影响生理和心理的健康，已经成为青少年残疾的一个主要的因素。以往认为，大多数先天性脊柱侧凸是非遗传性的，是胚胎在发育过程中由环境因素引起的。近年来，已有研究表明遗传因素参与了CS的发病机制。以前在动物模型中的基因操作实验表明遗传缺陷导致了脊椎异常。有趣地是，已表明人类基因(例如，DLL3，HES7，MESP2和T)的一些突变参与了CS的过程；然而，这些突变可从表型正常的家族成员那遗传而来。家族内部相同突变导致的不同表型的差异说明了人类CS遗传变异的复杂性。基因与环境的相互作用已被提出用于解释上述现象。自1983年至今北京协和医院骨科已收集神经纤维瘤病脊柱畸形样本178例，通过多种技术手段，对这些患者的临床信息、影像学资料(完整的X线、MRI和CT)及随访情况进行分析，发现其中非营养不良性脊柱侧凸患者42例(23.6％)，营养不良性脊柱侧凸患者136例(76.4％)。营养不良性脊柱侧凸患者不仅表现脊柱侧凸，而且具有严重的骨骼发育异常，其中有9例出现严重的肋椎关节脱位，肋骨突入椎管。同时营养不良性脊柱侧凸患者矫形手术后易出现融合失败、假关节形成等并发症，发生率高达25(18.4％)，矫形手术失败率远远高于先天性脊柱侧凸患者。由此可见，I型神经纤维瘤合并脊柱畸形是多系统的综合疾病，尤其以营养不良性I型神经纤维瘤合并脊柱侧凸为代表，此类患者术后易发生骨愈合缺陷，造成矫形手术失败，对患者的身体健康和生活质量造成极大影响。因此，深入探讨营养不良性I型神经纤维瘤合并脊柱侧凸相关的发病机制，发现造成此类患者骨骼愈合缺陷、矫形手术失败的根本性原因，并制定相应的治疗方案介入矫形手术和患者的术后康复，不仅可以推动I型神经纤维瘤合并脊柱畸形这类疾病的基础理论认识，同时相应治疗方案的改进对此类患者临床矫形手术成功率的提高具有十分重要的意义。鉴于目前还没有与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品早期诊断诊断产品，如能发现相应的标记物和研制相应的诊断试剂盒，将为探索I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病早期防治的药物靶点提供新的方向，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于寻找一种与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病相关的生物标志物—GPR56以及提供所述标志物在制备I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病检测或治疗产品中的应用；本专利技术的另一目的在于阐明GPR56与I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病发生的分子机制，寻找预防或治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的新途径。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：专利技术人通过10例(5&5)NF1合并脊柱畸形患者转录组测序，筛选到新的潜在关键基因—GPR56，并通过Westernblot验证GPR56蛋白在患者外周血中表达显著下调。进一步，专利技术人分别利用稳定敲低GRP56的神经纤维瘤细胞、成骨细胞和破骨细胞作为研究模型，观察敲低GRP56对细胞增殖、周期、以及对成骨细胞、破骨细胞分化相关标志物的影响。首先，本专利技术提供了GPR56作为标志物在如下任一项所述中的应用：1)在制备检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的产品中的应用；2)在制备治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的药物中的应用；3)在筛选预防或治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的候选化合物中的应用；4)在抑制骨吸收产品中的应用。优选的，所述检测，包括：a)鉴定受试者的样本中的标志物，其中所述标志物为GPR56；以及b)将所述标志物与参照进行比较，其中与参照相比的所述标志物的表达差异用于检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病。优选的，所述样本为血液或细胞。优选的，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。优选的，所述GPR56表达水平在I型神经纤维瘤合并脊柱畸形患者的样本中表达水平下调。优选的，所述GPR56在检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中作为标志物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。优选的，所述筛选预防或治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的候选化合物可以利用GPR56表达情况来进行筛选。在本专利技术的一种实施方式中，包括步骤：测试组中，在培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中GPR56的表达量和/或活性；在对照组中，在相同的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中GPR56的表达量和/或活性；本专利技术可以利用GPR56筛选预防或治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形的化合物，其中，如果测试组中细胞的GPR56的表达量和/或活性高于对照组，就表明该测试化合物是对GPR56的表达和/或活性有促进作用的治疗疾病的候选化合物。作为本专利技术的一种实施方式，所述的步骤还包括：对获得的候选化合物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选化合物中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形有用的物质。作为本专利技术的实施方式，筛选预防或治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形的候选化合物的体系不限于细胞体系，还包括亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系等，所述体系不局限于上述形式，只要所述体系可以检测测试化合物可以升高GPR56的表达和/活性即可。进一步地，本专利技术提供了一种检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的试剂盒，其包括检测样本中GPR56基因或其蛋白表达水平的试剂。优选的，所述试剂选自：特异性识别GPR56基因的探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.GPR56作为标志物在如下任一项所述中的应用：1)在制备检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的产品中的应用；2)在制备治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的药物中的应用；3)在筛选治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的候选化合物中的应用；4)在抑制骨吸收产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.GPR56作为标志物在如下任一项所述中的应用：1)在制备检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的产品中的应用；2)在制备治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的药物中的应用；3)在筛选治疗I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的候选化合物中的应用；4)在抑制骨吸收产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述GPR56在检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病患者的样本中表达水平下调。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GPR56在检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中作为标志物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。5.一种检测I型神经纤维瘤合并脊柱畸形病的试剂盒，其特征在于，其包括检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡思逸，邱贵兴，仉建国，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11