一种母乳酸性寡糖净化和分析方法技术

本发明专利技术涉及一种母乳酸性寡糖的净化与分析方法。其特征是：样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，再经在线的净化柱去除乳糖及中性寡糖干扰，获得的酸性糖经亲水作用色谱柱分离，蒸发光、电喷雾、紫外或质谱检测，得到母乳酸性糖结构、组成和含量信息。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，通量高等特点，适用于哺乳动物乳和人乳样品的快速、高通量分析。

Purification and analysis of acid oligosaccharides in breast milk

The invention relates to a method for purifying and analyzing acid oligosaccharides in breast milk. The characteristics of the sample are: centrifugation degreasing at low temperature, adding organic solvent to precipitate protein, and then removing lactose and neutral oligosaccharide by on-line purification column. The obtained acid sugar is separated by hydrophilic interaction column, and evaporated, electrospray, ultraviolet or mass spectrometry are used to detect the structure, composition and content of lactate sugar. The method has the advantages of good selectivity, good stability, simple operation, high throughput, and is suitable for rapid and high throughput analysis of mammalian and human milk samples.

【技术实现步骤摘要】
一种母乳酸性寡糖净化和分析方法
本专利技术涉及一种母乳酸性寡糖净化和分析方法。其特征是：样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白，静电排斥模式的柱色谱净化酸性寡糖，去除乳糖及中性寡糖干扰，再经在线HILIC柱分离分析，蒸发光、电喷雾、紫外或质谱检测，获得结构组成分析。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，通量高等特点，适用于大量母乳样品的快速分析。技术背景寡糖是母乳中重要组成成分，具有重要的生理功能。对婴儿的正常生长发育起着至关重要的作用，如抗炎、抗感染、免疫调控和维持肠道菌群平衡。寡糖包括酸性寡糖和中性寡糖，酸性寡糖是常被唾液酸化的寡糖，含量较中性寡糖低，但在体内起着不可替代的作用，如预防癌症发生、促进婴儿脑的正常发育等功能。在不同的人及动物乳中，酸性寡糖的种类和含量有一定的差异。深入了解母乳中酸性寡糖生物和药理活性的前提是对人和动物乳中酸性寡糖进行组成、结构和含量分析，因此，发展一种简单、快速、高通量的酸性寡糖的分析方法具有重要的意义。然而，由于酸性寡糖在母乳寡糖中含量低，在分析时乳糖及中性寡糖干扰严重，结构种类众多，从而增加了分析的难度。近年来，对母乳酸性寡糖分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种母乳酸性寡糖净化及分析方法，其特征是：母乳样品经过离心脱脂、沉淀除蛋白，净化柱除乳糖及中性寡糖，获得酸性寡糖馏分，直接在线进入亲水作用色谱(HILIC)柱分析，蒸发光、电喷雾、紫外或质谱检测，获得结构组分分析。

【技术特征摘要】
1.一种母乳酸性寡糖净化及分析方法，其特征是：母乳样品经过离心脱脂、沉淀除蛋白，净化柱除乳糖及中性寡糖，获得酸性寡糖馏分，直接在线进入亲水作用色谱(HILIC)柱分析，蒸发光、电喷雾、紫外或质谱检测，获得结构组分分析。2.按照权利要求1所述净化及分析方法，其特征是：离心脱脂步骤为：取母乳样品，于0-10℃条件下，500-50000g，优选2000-5000g，离心1-500分钟，优选5-30分钟，除去上层脂质；离心1-5次后，取下层既得脱脂母乳样品。3.按照权利要求1所述净化及分析方法，其特征是：沉淀除蛋白步骤为：取脱脂母乳样品，加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃500-50000g，优选2000-5000g，离心1-500分钟，优选5-30分钟，收集上层液；离心1-5次，合并上层溶液，得到脱脂除蛋白样品溶液或冻干得到的固体；有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、乙腈中的一种或几种。4.按照权利要求1所述净化及分析方法，其特征是：净化柱净化酸性寡糖步骤为：取脱脂除蛋白母乳固体样品，用体积浓度20-90％有机溶剂水溶液溶解样品，或直接取脱脂除蛋白母乳液体样品，通过自动进样器进入净化柱中，以具有静电排斥作用的亲水材料为色谱柱固定相，流动相为水和有机溶剂、或缓冲盐水溶液和有机溶剂，使用等度或梯度方法进行洗脱，酸性寡糖馏分直接在线进入串联的分析柱分析；亲水作用色谱分析酸性寡糖流出液的步骤为：酸性寡糖流出液直接在线通入HILIC柱，被捕集到HILIC柱，再进行分离分析，流动相为水和有机溶剂、或缓冲盐水溶液和有机溶剂，使用等度或梯度方法进行洗脱，检测。5.按照权利要求4所述净化及分析方法，其特征是：样品溶解液为有机溶剂甲醇、乙腈、乙醇、丙酮中的一种或两种以上和水混合溶液的体积比例为20-90％；洗脱液中的有机溶剂有：甲醇，乙腈，乙醇，异丙醇，丙酮中的一种或两种以上；洗脱液中所选择缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及pH如下：a)甲酸铵缓冲盐，浓度1-200mM，pH2-10；b)乙酸铵缓冲盐，浓度1-200mM，pH2-10；c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度1-200mM，pH2-10。6.按照权利要求1所述净化及分析方法，其特征是：净化柱填料为硅胶或硅胶表面键合极性基团的填料，所键合的极性基团有两性氨基酸、磺酰基、羧基和两性离子等中的一种或两种以上；HILIC分析柱填料为硅胶表面键合极性基团的材料，所键合的极性基团包括氨基酸、氨基、酰胺基、两性离子、季胺基基团的一种或两种以上；A、当净化柱填料为硅胶表面键合谷胱甘肽、天冬氨酸基团的一种或两种的材料时，净化柱净化酸性寡糖步骤采用的流动相为有机溶剂和水，HILIC柱填料...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，闫竞宇，郭志谋，丁俊杰，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21