一种艾塞那肽杂质含量的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种艾塞那肽杂质含量的分析方法，属于药物分析技术领域。本发明专利技术将艾塞那肽及三个特定杂质采用胰蛋白酶酶切，酶切后样品分别采用两种色谱方法进行分离，以外标法计算测定艾塞那肽中杂质[D‑His

【技术实现步骤摘要】
一种艾塞那肽杂质含量的分析方法
本专利技术属于药物分析
，具体涉及一种艾塞那肽杂质含量的分析方法。该分析方法能够简便分离和准确定量测定艾塞那肽三个特定杂质，可作为艾塞那肽质量控制的重要组成部分。
技术介绍
艾塞那肽(Exenatide)是美洲巨蜥蜴毒液中提取分离的含有39个氨基酸的多肽序列，与GLP-1具有53％的同源性，由于不易被DPP-Ⅳ降解而表现出更强的稳定性及生物活性。艾塞那肽为GLP-1受体激动剂，可促进胰岛素分泌，主要用于改善Ⅱ型糖尿病患者的血糖控制。艾米林制药公司(Amylin)与美国礼来公司共同研发的艾塞那肽注射液(Byetta，百泌达)于2005年在美国上市，长效艾塞那肽(Bydureon，百达扬)分别于2011年获得欧盟批准，2012年获得FDA批上市。艾塞那肽原料药采用固相合成方法制备，在艾塞那肽合成工艺中会产生一系列与其结构、性质类似的杂质，如非对映异构体、缺失肽等，目前已公开的艾塞那肽有关物质检测方法分离能力较差，无法对特定杂质进行准确分离定量，尤其是对非对映异构体杂质[D-His1]-艾塞那肽的分离困难较大。有文献报道，将艾塞那肽全水解为氨基酸，采用氘代试剂衍生后，利用气相手性色谱柱分离，质谱定量检测的方法对杂质[D-His1]-艾塞那肽进行控制，该方法所用仪器、试剂及色谱柱均较为特殊，检测成本高，且方法操作繁琐，重复性较差。为有效分析和检测药品质量，保证用药安全，仍需要开发出一种便捷、有效检测艾塞那肽相关杂质的分析方法。艾塞那肽及需检测杂质的序列结构如下：1)艾塞那肽H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH22)[D-His1]-艾塞那肽H-D-His1-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH23)[DoublePro38]-艾塞那肽H-His1-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro38-Pro38-Ser39-NH24)[Des-Gly2]-艾塞那肽H-His1-Glu3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2艾塞那肽与三个特定杂质均为长链多肽物质，其中个别氨基酸的微小差异对多肽的化学性质无影响。尤其是非对映异构体杂质[D-His1]-艾塞那肽，其结构与艾塞那肽相似，物理化学性质也几乎无差异，采用常规液相色谱方法均无法分离并准确定量测定。因此，有必要寻找一种能有效分离上述相关艾塞那肽杂质的检测方法。专利技术人通过大量研究发现了一种可以有效分离并准确定量分析上述各杂质的检测方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种可有效分离并准确定量艾塞那肽特定杂质的方法，旨在解决艾塞那肽及其特定杂质[D-His1]-艾塞那肽、[DoublePro38]-艾塞那肽及[Des-Gly2]-艾塞那肽的分离与定量测定。本专利技术所采用的胰蛋白酶能够特异性作用于上述多肽序列中第12位、27位赖氨酸和第20位精氨酸的羧端C-O键，使艾塞那肽及特定杂质均酶解为四个肽段。艾塞那肽酶解四个肽段(分别命名为T1、T2、T3及T4肽段)T1段：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓T4段：Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2同理：杂质[D-His1]-艾塞那肽可酶解四个肽段(分别命名为D-T1、T2、T3及T4肽段)D-T1段(即[D-His1]-T1段)：D-His1-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓T4段：Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2杂质[DoublePro38]-艾塞那肽可酶解四个肽段(分别命名为T1、T2、T3及T4ˊ肽段)T1段：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓T4ˊ段(即[DoublePro38]-T4段)：Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro38-Pro38-Ser39-NH2杂质[Des-Gly2]-艾塞那肽可酶解四个肽段(分别命名为T1ˊ、T2、T3及T4肽段)T1ˊ段(即[Des-Gly2]–T1段)：H-His1-Glu3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys12↓T2段：Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20↓T3段：Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys27↓T4段：Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2表1：艾塞那肽及特定杂质分离目标肽段(加粗部分为目标分离肽段)名称水解后产生的4个肽片段艾塞那肽T1、T2、T3、T4[DoublePro38]-艾塞那肽T1、T2、T3、[DoublePro38]-T4[Des-Gly2]-艾塞那肽[Des-Gly2]–T1、T2、T3、T4[D-His1]-艾塞那肽[D-His1]-T1、T2、T3、T4利用艾塞那肽酶解肽段与杂质肽酶解肽段的不同，采用高效液相色谱法对不同的肽段进行分离，从而达到定量检测艾塞那肽特定杂质的目的。(例如:艾塞那肽与[D-His1]-艾塞那肽，两者酶解后均产生4个肽段，仅T1与[D-His1]-T1肽段不同，其余3个肽段均相同，采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种艾塞那肽杂质含量的分析方法，其步骤包括：采用胰蛋白酶对艾塞那肽及其杂质进行酶解，然后采用色谱法进行分离。

【技术特征摘要】
1.一种艾塞那肽杂质含量的分析方法，其步骤包括：采用胰蛋白酶对艾塞那肽及其杂质进行酶解，然后采用色谱法进行分离。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述艾塞那肽杂质为[D-His1]-艾塞那肽、[DoublePro38]-艾塞那肽或[DesGly2]-艾塞那肽。3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：采用0.05mg/ml胰蛋白酶对艾塞那肽产品杂质[DoublePro38]-艾塞那肽、[Des-Gly2]-艾塞那肽及艾塞那肽样品特定位点进行酶切水解，并对水解产生的特定酶切肽段用色谱进行分离，并采用外标法准确定量。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：采用冰乙酸或者稀磷酸终止胰蛋白酶酶切反应。5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：当杂质为[D-His1]-艾塞那肽时，色谱分析采用强阳离子交换色谱柱，以磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相。6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：当杂质为[DoublePro38]-艾塞那肽或[DesGly2]-艾塞那肽时，色谱分析采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以氯化钾溶液作为流动相A，以乙腈溶液为流动相B。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述强阳离子交换色谱柱的粒径为3μm，色谱柱长度为100mm，色谱柱内径为4.6mm；...

【专利技术属性】
技术研发人员：代连花，赵慧英，张磊，张林，
申请(专利权)人：齐鲁制药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37