多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用技术

多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8‑13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用，涉及一种环化杂合肽及其合成方法和应用。是要解决现有阿片类药物的抗酶解能力较差，抗神经性疼痛效果不佳的问题。该杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4。方法：一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理；二、脱除“Fmoc”保护基团；三、氨基酸缩合反应；四、肽链的延长；五、二硫键的形成；六、肽链从树脂上的切割；七、粗肽的脱盐与纯化。本发明专利技术通过多位点非天然氨基酸替换以及环化修饰也能够增强杂合肽的生物稳定性，并具有抗神经性疼痛的作用。本发明专利技术的杂合肽用于制备抗神经性疼痛药物。

【技术实现步骤摘要】
多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用
本专利技术涉及一种环化杂合肽及其合成方法和应用。
技术介绍
几个世纪以来，阿片及其提取物一直用于镇痛治疗。从阿片中分离出的吗啡就是现在临床应用最广泛的镇痛药物之一。然而吗啡等药物在安全临床使用的缺陷也很多，如抑制呼吸、引起血压降低和心搏徐缓、便秘、易引起精神依赖、成瘾和镇痛耐受等。此外，吗啡对慢性疼痛如神经病理性疼痛的治疗效果不佳。众所周知，阿片肽在痛觉信息的传递和调制过程中起着重要作用。早在1974年，学者们就从猪脑中提取到了两个具有吗啡样阿片活性的五肽，即甲硫氨酸脑啡肽(Met-enkephalin)和亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephalin)，两者统称为脑啡肽(enkephalins)。它们对δ-阿片受体具有较高的亲和性和选择性，被认为是δ-阿片受体的内源性配体。两种脑啡肽通过与其受体结合降低神经细胞内cAMP水平和钙离子的传导，抑制痛觉调节系统的神经传递，进而发挥镇痛作用。在生理浓度下，甲硫氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽均不易对机体产生精神依赖性，且药物耐受形成较慢。然而脑啡肽的镇痛活性相对较弱，明显低于μ-阿片受体激动剂如吗啡等介导的镇痛效果。此外，脑啡肽的生物稳定性较差，镇痛持续时间较短，血脑屏障通透率较低，从而限制了其作为临床镇痛药物的发展。1973年美国生理学家从牛下丘脑中发现了由13个氨基酸组成的活性神经肽，即神经降压素(neurotensin，NT)。在中枢神经系统内，神经降压素作为神经递质或调质而发挥作用,其效应包括降温、镇痛、调节多巴胺能传递和刺激垂体前叶激素释放。神经降压素在抑制痛觉传递过程中与阿片肽有着重要的关系。神经降压素神经末梢及神经降压素受体在中枢神经系统内广泛分布于与镇痛有关的区域，而且与内源性阿片肽神经末梢及阿片受体分布相伴行。有研究表明，中枢注射神经降压素产生的镇痛效应与激活阿片系统，引起内源性阿片肽的释放有关。此外，已经证实神经降压素的第8-13位氨基酸“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”是神经降压素的活性最小片段，其氨基酸序列中有两个带正电的精氨酸。精氨酸的胍基基团能够与细胞表面的阴离子基团形成二价的氢键，增强多肽对生物膜的通透性，如血脑屏障。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有阿片类药物的抗酶解能力较差，抗神经性疼痛效果不佳的问题，提供多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用。本专利技术多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu。其中序列“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)”和“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)”分别为多位点修饰的环化的甲硫氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽的残基序列，“Gly”和“D-Ala”为杂合肽的中间连接子，“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”为多位点修饰的神经降压素(8-13)的残基序列。(Dmt代表2,6-二甲基Tyr，NMePhe代表N-甲基Phe，NMeArg代表N-甲基Arg，Tle代表tert-Leu)上述多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，包括以下步骤：一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；五、二硫键的形成：称取I2溶于无水甲醇和DMF混合液中，配成I2溶液，并将I2溶液加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液；其中混合溶液中无水甲醇和DMF的体积比为4：1，I2的质量与混合溶液的体积比为2.6g：100mL，I2溶液与肽树脂的体积比为100mL：1g；六、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，充分抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3～5h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置后去除乙醚上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽；七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8‑13)相偶联的环化杂合肽，其特征在于该杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt‑Gly‑c(Cys‑NMePhe‑Met‑Cys)‑Gly‑NMeArg‑Lys‑Pro‑Trp‑Tle‑Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt‑Gly‑c(Cys‑NMePhe‑Leu‑Cys)‑Gly‑NMeArg‑Lys‑Pro‑Trp‑Tle‑Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt‑Gly‑c(Cys‑NMePhe‑Met‑Cys)‑D‑Ala‑NMeArg‑Lys‑Pro‑Trp‑Tle‑Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt‑Gly‑c(Cys‑NMePhe‑Leu‑Cys)‑D‑Ala‑NMeArg‑Lys‑Pro‑Trp‑Tle‑Leu。

【技术特征摘要】
1.多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽，其特征在于该杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu。2.如权利要求1所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMe...

【专利技术属性】
技术研发人员：王长林，张雨哲，袁碧玉，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23