一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法技术

本发明专利技术公开了一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，包括：(1)将可光固化生物水凝胶用含有光引发剂的PBS溶液溶解，制得两种浓度生物墨水；(2)收集细胞汇合度80％以上的间充质干细胞，处理后使用低浓度生物墨水重悬间充质干细胞，得到载细胞生物墨水；(3)将载细胞生物墨水和高浓度的生物墨水分别装入生物3D打印装置的两个喷头中；(4)设置打印参数，首先在匀速旋转的光轴上打印载细胞生物墨水，得到第一层神经导管；然后打印高浓度生物墨水，得到双层中空管状神经导管；(5)进行紫外光照射，得生物型多层神经导管。利用本发明专利技术，制备耗时短、简单，操作条件温和，制备的神经导管结构简单，生物相容性好，可降解。

【技术实现步骤摘要】
一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法
本专利技术属于神经导管的设计与制备领域，尤其是涉及一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法。
技术介绍
神经系统(nervoussystem)是机体内对生理功能活动的调节起主导作用的系统，主要由神经组织组成，分为中枢神经系统和周围神经系统两大部分。各种外伤如压迫、牵伸、撕裂等和肿瘤、局部缺血等其他因素易造成神经系统损伤，从而导致神经系统功能缺失和其他神经性疾病，严重降低患者的工作和生活的质量。目前主流的神经修复技术有如下几种：直接吻合、自体同源或异体同源神经移植以及借助神经导管修复。直接吻合只可以用于神经断伤较短(<8mm)的情况，且其疗效优良率不高；而自体同源或异体同源神经移植会导致供区神经功能丧失，存在二次手术等问题，而神经导管修复术(桥接术)却可以弥补前两项技术的不足之处，吸引着越来越多研究者和医生的目光。公开号为CN108379667A的中国专利文献公开了一种新型生物降解神经导管及其制备技术，提出了由聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚碳酸亚乙酯、聚乳酸和聚乙醇酸中的一种或几种制得管状神经导管的方法，首先将所选材料溶于极性溶剂制得溶解液，然后将溶解液涂布或平铺于模具上，得到带有溶解液的模具，接着将所述带有溶解液的模具置于水中，即得管状支架。该制备方法采用的生物材料可降解，不会引起对神经生长的嵌压，且制备方法简单易操作。但是该方法采用的溶液置换法制备神经导管十分耗时，仅加热和干燥过程就分别需要1.5-2h和36-48h，不能满足急迫的神经导管需求；而且采用的制造工艺只能制备简单结构的神经导管，不能对神经导管的微观结构进行设计，比如神经导管的孔隙大小、孔隙分别以及孔隙率。随着组织工程的不断发展，研究者们发现神经生长因子或种子细胞有利于加快周围神经的形貌和功能性恢复，遂此制备含神经生长因子或者种子细胞的神经导管逐渐兴起。公开号为CN105597148A的中国专利文献公开了一种用于神经损伤修复的神经支架的方法。该神经支架包括胶原支架、培养在胶原支架上的神经干细胞、以及由肝素固定在胶原支架上的生长因子。该方法的具体制备工艺如下：首先配制胶原溶液；然后将溶液倒入磨具，通过冻干灭菌得到胶原海绵；接着将胶原海绵依次浸泡于含肝素的交联溶液和生长因子溶液；最后神经干细胞原代培养于上述神经支架上，得到载细胞和生长因子的神经导管。该制备方法取材方便，步骤简单，避免了酸碱中和、透析等复杂步骤，减少了胶原材料接触有害试剂的机会，所获得的神经支架安全性提高。但是神经导管上生长因子和神经干细胞的贴附位置、分布密度等随机的，不可控，无法获得神经干细胞和神经生长因子均匀分布、梯度分布的或者程序性分布的神经导管。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，制备耗时短、简单，操作条件温和，制备的神经导管结构简单，生物相容性好，可降解，不会引起对神经生长的嵌压。一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，包括：(1)将可光固化水凝胶用含有光引发剂的PBS溶液溶解，制得低浓度和高浓度两种生物墨水；(2)收集培养皿内细胞汇合度80％以上的间充质干细胞，进行消化、离心处理后，使用步骤(1)制得的低浓度生物墨水重悬间充质干细胞，得到载细胞生物墨水；(3)将载细胞生物墨水和步骤(1)制得的高浓度的生物墨水分别装入生物3D打印装置的两个喷头中，通过后处理使生物墨水都成凝胶状；(4)设置生物3D打印装置的打印参数，按照预先设定的指令，首先在匀速旋转的光轴上打印载细胞生物墨水，得到第一层神经导管；然后在第一层神经导管表面打印高浓度生物墨水，得到初始双层中空管状神经导管；(5)将得到的初始双层中空管状神经导管进行紫外光照射，得生物型多层神经导管。上述方法通过降温交联、基于挤出成形的生物3D打印技术、紫外光固化制得结构稳定、力学强度好的神经导管，整个制作过程耗时短，操作简便，工作条件温和。利用该方法制得的神经导管可立即移入体内帮助治疗神经缺损，也可在体外培养一定时间后移入体内。优选地，步骤(1)中使用的可光固化生物水凝胶为甲基丙烯酸明胶。此种水凝胶在配制时通过过滤除菌、冷冻干燥得到无菌的甲基丙烯酸明胶固体。甲基丙烯酸明胶是生物可降解人工合成聚合物，降解产物无害，并且可以通过控制甲基丙烯酸明胶配制的生物墨水的浓度控制其制得的神经导管的降解速率。同时，甲基丙烯酸明胶具有温敏性，可以通过降低墨水温度的物理方式使其交联。优选地，步骤(1)中使用的光引发剂为传统的2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙二酮(Irgacure2959)或苯基-1,4-6-三甲基苯甲酰膦酸锂(LAP)中的一种。进一步地，光引发剂在PBS溶液中的浓度为0.05％-0.1％(w/v)。优选地，步骤(1)中，低浓度生物墨水中的甲基丙烯酸明胶浓度为5％-15％(w/v)，高浓度生物墨水中的甲基丙烯酸明胶浓度为20％-30％(w/v)。进一步优选，低浓度生物墨水中的甲基丙烯酸明胶浓度为5％(w/v)，高浓度生物墨水中的甲基丙烯酸明胶浓度为30％(w/v)。优选地，步骤(2)中，所述的间充质干细胞为骨髓间充质干细胞(BMSC)。所述的载细胞生物墨水中的间充质干细胞密度为1.0*106-1.0*107ml-1。优选地，步骤(3)中，所述生物3D打印装置的两个喷头的温度分别低于载细胞生物墨水和高浓度的生物墨水胶凝点温度1-3℃。通过控制放置喷头的设备的温度间接控制喷头内生物墨水的温度，通过甲基丙烯酸明胶的低温交联特性，降低墨水温度使其呈凝胶态，便于挤出成丝。步骤(4)中，在打印时，从喷头中挤出的丝粘附到以一定角速度旋转的与电机紧密连接的光轴上，喷头做电机光轴轴线方向的往返运动。优选地，光轴的转速为15-25rpm，喷头移动速度为100-300mm/min。进一步优选，光轴的转速为20rpm，喷头移动速度200mm/min。所述光轴的外径为1-5mm，所述喷头的针头内径为159-603μm。优选地，步骤(5)中，所述的紫外光波长365nm，紫外光照射密度为2W/cm2，光照时间30-60s。最终制得的神经导管内层机械强度低于外层机械强度。内层载机械强度低，有利于间充质干细胞贴附、铺展、繁殖、分化，促进神经缺损修复；外层机械强度高，起着支撑作用，维持整个导管的稳定性。神经导管内层压缩模量在2-200KPa，拉伸模量在2-40KPa；外层机械压缩模量为350-700KPa，拉伸模量为50-150KPa。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1、本专利技术采用材料即甲基丙烯酸明胶(GelMA)是明胶经接枝反应后得到的产物，具有明胶优良的生物相容性、生物可降解和温敏性等，还具有光固化的特性。因此本专利技术的神经导管通过紫外光固化，操作条件十分温和，不威胁操作者身体健康，且未接触到许多的有毒试剂，加强了导管的安全性。2、本专利技术采用材料即甲基丙烯酸明胶(GelMA)降解性能可以通过调节其生物墨水浓度间接调节，因此可以完全满足医学上对不同降解时间的神经导管的需求。3、本专利技术整体采用基于挤出成形的生物3D打印技术制备初始双层神经导管后通过紫外光固化，整个制备过程耗时相当短，完全满足急迫的神经导管需求。而且通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，其特征在于，包括：(1)将可光固化生物水凝胶用含有光引发剂的PBS溶液溶解，制得低浓度和高浓度两种生物墨水；(2)收集培养皿内细胞汇合度80％以上的间充质干细胞，进行消化、离心处理后，使用步骤(1)制得的低浓度生物墨水重悬间充质干细胞，得到载细胞生物墨水；(3)将载细胞生物墨水和步骤(1)制得的高浓度的生物墨水分别装入生物3D打印装置的两个喷头中，使生物墨水都成凝胶状；(4)设置生物3D打印装置的打印参数，按照预先设定的指令，首先在匀速旋转的光轴上打印载细胞生物墨水，得到第一层神经导管；然后在第一层神经导管表面打印高浓度生物墨水，得到初始双层中空管状神经导管；(5)将得到的初始双层中空管状神经导管进行紫外光照射，得生物型多层神经导管。

【技术特征摘要】
1.一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，其特征在于，包括：(1)将可光固化生物水凝胶用含有光引发剂的PBS溶液溶解，制得低浓度和高浓度两种生物墨水；(2)收集培养皿内细胞汇合度80％以上的间充质干细胞，进行消化、离心处理后，使用步骤(1)制得的低浓度生物墨水重悬间充质干细胞，得到载细胞生物墨水；(3)将载细胞生物墨水和步骤(1)制得的高浓度的生物墨水分别装入生物3D打印装置的两个喷头中，使生物墨水都成凝胶状；(4)设置生物3D打印装置的打印参数，按照预先设定的指令，首先在匀速旋转的光轴上打印载细胞生物墨水，得到第一层神经导管；然后在第一层神经导管表面打印高浓度生物墨水，得到初始双层中空管状神经导管；(5)将得到的初始双层中空管状神经导管进行紫外光照射，得生物型多层神经导管。2.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的可光固化生物水凝胶为甲基丙烯酸明胶。3.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的光引发剂为2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙二酮或苯基-1,4-6-三甲基苯甲酰膦酸锂中的一种，光引发剂在PBS溶液中的浓度为0.05％-0.1％(w/v)。4.根据权利要求1所述的含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹俊，俞梦飞，刘婧懿，严梦玲，傅建中，吴俊杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33