一种检测牛环曲病毒的试剂盒及RT-PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测牛环曲病毒的试剂盒，该试剂盒包含检测牛环曲病毒的引物、RNA提取试剂、反转录试剂、阳性对照和阴性对照，所述引物的核苷酸序列为上游引物P1：5’‑GGTGCCGTTGTTGTGTCA‑3’，下游引物P2：5’‑CAGCCCTGAGTTGCCTTATC‑3’；阳性对照为BCoV，BNoV，BAstV，BRV，BVDV和BKV，阴性对照为无菌双蒸水。本发明专利技术还公开了一种检测牛环曲病毒的RT‑PCR方法，步骤如下：（1）合成上述用于检测牛环曲病毒的引物；（2）提取待测样品中的RNA，以提取的RNA为模板反转录得到其cDNA；（3）以步骤（2）制得的cDNA为模板，采用步骤（1）合成的引物组进行PCR扩增反应；（4）分析PCR扩增产物。简便实用、经济高效，可以大大提高检测效率，节约检测时间。

A Kit for Detecting Bovine Circumflex Virus and RT-PCR Detection Method

The invention discloses a kit for detection of bovine cyclovirus, which comprises primers for detection of bovine cyclovirus, RNA extraction reagents, reverse transcription reagents, positive control and negative control. The nucleotide sequence of the primers is upstream primer P1:5'GGGTGCCGTTGTTGTGTCA 3', downstream primer P2:5' CAGCCCTGATTGTTGCCATC 3'; and the positive control is BCoV, BNoV. BAstV, BRV, BVDV and BKV, the negative control was sterile double steamed water. The invention also discloses a RT_PCR method for detection of bovine cyclovirus, the steps are as follows: (1) synthesizing the above primers for detection of bovine cyclovirus; (2) extracting RNA from the sample to be tested and retranscribing the extracted RNA to obtain its cDNA; (3) using the extracted RNA as template, using the synthesized primer group as PCR amplification reaction; (4) analyzing. PCR amplification products. Simple, practical, economical and efficient, can greatly improve the detection efficiency and save detection time.

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛环曲病毒的试剂盒及RT-PCR检测方法
：本专利技术属于PCR检测
，具体涉及牛环曲病毒的RT-PCR检测方法及其应用。
技术介绍
：牛环曲病毒(Bovinetorovirus，BToV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)环曲病毒属(Torovirus)的成员。基因组为单股正链RNA，大小约为25～30kb。该病毒首次于1979年在美国腹泻犊牛的粪便中分离得到，命名为布里达病毒(Bredavirus)，即BToV。BToV自首次报道以来有近40年历史，其在世界范围内广泛分布，在全球范围内从腹泻犊牛粪便中BToV的检出率已达到2.9-36.4％，而我国目前尚无有关BToV的报道，在BToV领域仍处于技术盲区，对牛感染牛环曲病毒的预防及治疗尚无有效措施。牛感染环曲病毒后，会引起腹泻和呼吸系统疾病，病牛精神沉郁，食欲不振，排黄、白色半固体或大量水样稀粪。4月龄以下犊牛易感，1月龄以下的腹泻犊牛是本病主要传染源，该病主要通过呼吸道或消化道传播。与冠状病毒相似，BToV引起犊牛腹泻可能是病毒感染造成肠道吸收不良，或体液分泌过多所致。目前本病尚无特效治疗办法。
技术实现思路
：本专利技术目的在于提供一种检测牛环曲病毒的试剂盒和RT-PCR检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一种用于牛环曲病毒PCR检测的特异性引物，所述引物是根据牛环曲病毒刺突糖蛋白基因序列的高度保守区域设计的，其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’-GGTGCCGTTGTTGTGTCA-3’下游引物P2：5’-CAGCCCTGAGTTGCCTTATC-3’。本专利技术还提供一种用于检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，所述试剂盒的成分组成中含有权利要求1所述的引物。上述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，所述试剂盒还含有RNA提取试剂、反转录试剂、阳性对照和阴性对照。上述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，所述阳性对照为BCoV，BNoV，BAstV，BRV，BVDV和BKV；所述阴性对照为无菌双蒸水。上述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，所述PCR扩增片段长度为698bp。本专利技术还提供一种检测牛环曲病毒的RT-PCR检测方法，包括以下步骤：(1)引物设计及合成：设计并合成权利要求1所述的引物；(2)样品处理：将样品用PBS按1:10(w:v)混悬，旋涡震荡30s，4℃、8000r/min离心5min，收集上清，-80℃保存备用；(3)病毒RNA提取、反转录：提取待测样品中的RNA，以提取的RNA为模板反转录得到其cDNA；(4)PCR扩增:以步骤(3)制得的cDNA为模板，采用步骤(1)合成的引物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；(5)分析PCR扩增产物：将所得PCR扩增产物采用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。上述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR检测方法，步骤(3)中采用ViralRNA/DNAExtractionKit提取RNA，提取所得的RNA采用1stStrandcDNASynthesisKit制备cDNA。上述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR检测方法，步骤(4)中所述PCR扩增反应的反应体系为：PremixTaq10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，cDNA模板1.0μL，ddH2O补足20μL。上述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR检测方法，步骤(4)中所述的PCR扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸7min。本专利技术的有益效果：本专利技术根据GenBank中收录的牛环曲病毒的基因序列，对病毒各基因区进行同源性分析，选取了BredavirusS基因，登录号为NC_007447的序列，设计了1对用于检测牛环曲病毒的特异性引物。目前国内还没有有关牛环曲病毒的技术记载，更没有牛环曲病毒相关的检测方法，而本专利技术的RT-PCR检测方法具有很强的敏感性，专门针对牛环曲病毒设计，对牛环曲病毒的最低检出限为1.36×104copies/μL；而且本专利技术的引物特异性极强，对牛冠状病毒(BCoV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛星状病毒(BAstV)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛嵴病毒(BKV)的扩增结果均为阴性；对同一样品每隔一周进行1次检测，连续检测3周，都获得相同的结果，表明本专利技术的RT-PCR检测方法重复性好；除此之外，还可以对临床样品进行大批量的检测，实现对牛环曲病毒的实时监测，对牛环曲病毒的流行病学调查提供技术支持，简便高效、经济实用，具有广泛的应用前景。附图说明：图1为本专利技术所述PCR反应程序对退火温度的优化结果；其中M为DL2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)，泳道1-6退火温度分别为42，43，46，49，52，54℃。图2为本专利技术所述PCR反应体系对引物用量的优化结果；其中M为DL2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)，泳道1-6引物用量分别为0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0μL。图3为本专利技术所述PCR反应体系对cDNA模板用量的优化结果；其中M为DL2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)，泳道1-7模板用量分别为0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0μL。图4为本专利技术RT-PCR检测方法的特异性检验结果；其中，M为DL2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)，泳道1为BToV的PCR产物；泳道2-7分别为BNoV，BCoV，BRV，BAstV，BVDV，BKV的PCR产物；泳道8为阴性对照。图5为本专利技术RT-PCR检测方法的敏感性检验结果；其中，M为DL2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)，泳道1-9分别为1.36×109-1.36×101copies/μL，泳道10为阴性对照。图6为本专利技术RT-PCR检测方法的重复性检验结果；A，B和C分别代表第一、三和五周的RT-PCR；其中M为DL2000marker(条带从上至下为2000、1000、750、500、250、100bp)，泳道1为BToV；泳道2为阴性对照。具体实施方式：下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：牛环曲病毒RT-PCR检测方法1、用于检测牛环曲病毒的引物的设计与合成对GenBank中公布的牛环曲病毒的序列进行同源性比对分析，选取BredavirusS基因，登录号为NC_007447的序列，利用Oligo6.0软件设计1对特异性引物。所述引物的核苷酸序列为上游引物：5’-GGTGCCGTTGTTGTGTCA-3’，下游引物：5’-CAGCCCTGAGTTGCCTTATC-3’。所述引物预计扩增片段大小为698bp。2、临床样品处理及病毒核苷酸的提取以在河南地区的牛场采集的133份粪便作为临床样品。将临床样品用PBS按1:10(w:v)混悬，漩涡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于牛环曲病毒PCR检测的特异性引物，其特征在于，所述引物是根据牛环曲病毒刺突糖蛋白基因序列的高度保守区域设计的，其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’‑GGTGCCGTTGTTGTGTCA‑3’下游引物P2：5’‑CAGCCCTGAGTTGCCTTATC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于牛环曲病毒PCR检测的特异性引物，其特征在于，所述引物是根据牛环曲病毒刺突糖蛋白基因序列的高度保守区域设计的，其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’-GGTGCCGTTGTTGTGTCA-3’下游引物P2：5’-CAGCCCTGAGTTGCCTTATC-3’。2.一种检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，其成分组成中含有权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有RNA提取试剂、反转录试剂、阳性对照和阴性对照。4.根据权利要求3所述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为BCoV，BNoV，BAstV，BRV，BVDV和BKV；所述阴性对照为无菌双蒸水。5.根据权利要求3所述的一种检测牛环曲病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，RT-PCR扩增片段长度为698bp。6.一种检测牛环曲病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物设计及合成：设计并合成权利要求1所述的引物；(2)样品处理：将样品用PBS按w:v为1:10混悬，旋涡震荡30s，4℃、8000r/min离心5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：师志海，兰亚莉，王璟，王文佳，焦文强，徐照学，孟红丽，王亚州，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41