联合免疫效果早期快速评价方法中的试剂及其应用技术

本发明专利技术公开了一种改良型溶血素，该溶血素由皂角苷、多聚甲醛、Triton X‑100配制而成。在重症ACLF患者中，本发明专利技术的改良型溶血素溶血后单核细胞的比例明显高于BD Lysing

Reagent and its application in early rapid evaluation of combined immune response

The invention discloses an improved hemolysin, which is prepared from saponin, polyformaldehyde and Triton X_100. In patients with severe ACLF, the proportion of monocytes after hemolysis of the improved hemolysin of the present invention is significantly higher than that of BD Lysing.

【技术实现步骤摘要】
联合免疫效果早期快速评价方法中的试剂及其应用
本专利技术属于生物医学领域，涉及联合免疫效果早期快速评价方法中的试剂及其应用。
技术介绍
流式细胞仪已应用于科学研究和医学临床检验的各个领域，如免疫功能的检查，肿瘤抗原，转移基因与抑癌基因及其他疾病相关基因的检测，细胞凋亡，艾滋病诊断与预后判断等。流式细胞术(flowcytometry，FCM)可以对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，是当代生命科学领域中先进技术之一，在基础研究及临床检测等领域得到广泛应用。白细胞分群和计数是医学诊断中分析人体血液的重要指标。血液中的白细胞有五种类型，淋巴细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，后三种统称为粒细胞，因此将白细胞分为三个亚群，即为淋巴细胞，单核细胞，粒细胞。有效分离出比例高的单核细胞是联合免疫效果早期快速评价方法中的重要环节。因为生物恐怖剂感染来势凶险、病原复杂，基于单一免疫制剂的免疫方案往往不能发挥有效的防护作用，急需研发新的联合免疫技术。为了应对生物恐怖剂和战剂的威胁，美国在20世纪80年代生物防恐部门颁布了《联合免疫条令》，重点发展包括联合疫苗、广谱药物在内的联合对抗措施。目前我国还没有成熟的生物恐怖剂的联合疫苗或联合免疫方案。因为联合免疫存在很多不确定性，各个成员间免疫应答是促进还是抑制，干扰程度如何，已经被感染后二重感染效率等都会影响联合免疫的效果。此外，在需要应急联合免疫的情况下，制定合理的联合免疫方案后，如何快速、高通量评价联合免疫的效果，是一个亟待解决的难题。现有的免疫效果评价标准包括中和抗体的水平以及细胞免疫反应尤其是CD8+T细胞(TcytotoxicTcells，Tc)反应的强弱两个方面。但从免疫到检测抗体等的产生需要10天以上的时间，此检测方法不利于应急联合免疫情况下的效果评价，需要新的评价方法及技术在免疫初期即可判断联合免疫效果。本领域技术人员可知，天然免疫细胞中的巨噬细胞在病原微生物早期的吞噬、清除中发挥关键作用，巨噬细胞可分化为促进抗感染应答的M1型，以及抑制免疫应答的M2型。文献报道及研究发现巨噬细胞表型与后期的细胞免疫应答能力相关，及M1表型导致强的抗感染免疫应答，而M2表型意味着低的抗感染细胞免疫应答，从而提示可以通过早期分析巨噬细胞表型快速判断疫苗的联合免疫效果。巨噬细胞是由单核细胞诱导而成，为了在体外研究是否可以通过研究巨噬细胞表型以实现快速判断疫苗联合免疫效果的目的，需要获取大量的单核细胞，这就需要对血液中的白细胞进行高效分离。溶血素是白细胞计数或白细胞分类的关键试剂，属于临床检验最常用的试剂之一，与稀释液等配套用于血细胞分析仪(如流式细胞仪)中。白细胞分类计数需要稀释血液样本，并且需要特异的溶血素，一方面，溶血素使红细胞(RBC)迅速溶解，溶解红细胞后进行白细胞计数，以免干扰白细胞的检测(因为血液中的红细胞数量远远多于白细胞数量)。另一方面，为了保证白细胞三个亚群的检测，白细胞的体积也需要一定程度的改变，此时的白细胞膜需要一定程度的溶解，以便释放出胞浆，同时维持细胞核的完整状态，保持一定体积以便进行分群测定。在血样品处理中，溶血素对外周血的细胞分群会产生明显的影响，不同的溶血素对不同疾病的实验结果有着显著的影响。目前，流式细胞仪所用溶血素基本依靠进口，并且不能及时供应，给使用者带来很大的不便和浪费。
技术实现思路
流式细胞仪检测的标本可以是密度梯度离心法得到的外周血单个核细胞(PMBC)，也可以是未离心的抗凝血。PMBC标本制备需要花一定时间进行分离，而且有些表面分子标志在分离完PMBC后会明显降低，不能真实地反映体内的结果。而将新鲜采集的外周血进行红细胞裂解后再进行流式染色分析，不仅操作更为简便，时间大为缩短，而且原本受淋巴细胞分离液影响的表面分子在溶血后也基本不会发生变化，与体内结果最为接近。裂解红细胞的方法很多，但是无论哪种裂解液，在裂解红细胞的同时也会或多或少地影响白细胞的活力或造成细胞的丢失。因此，不同的疾病和研究对象应采用不同的裂解方法，以求最接近体内的真实结果。本专利技术改良后的溶血素和BDLysingTMsolution相比，红细胞溶解效果都比较好，在FSC/SSC图形中各个细胞群分群也都非常明显。这两种溶血素对HC、CHB患者的中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的比例都没有明显影响。但本研究结果显示，在重症ACLF患者中，改良后的溶血素溶血后单核细胞的比例明显高于BDLysingTMsolution溶血的比例，说明改良后的溶血素对单核细胞损伤要小于BDLysingTMsolution，因此能够获得更高比例的单核细胞。申请人以往的实践也发现来自重症ACLF患者的PBMC数量远远少于健康人；再加上单核细胞在外周血的比例较低，这使得重症ACLF患者外周血中单核细胞的研究更加困难。全血细胞染色操作简便，而且大大减少了分离淋巴细胞时单核细胞损失，所以在单核细胞研究中更具有优势。并且，本专利技术结果显示出改良后的溶血素在重症ACLF患者中能够获得更高比例的单核细胞，这无疑更加有利于单核细胞的研究。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种血细胞分析用的改良型溶血素，所述溶血素包括以下组分：皂角苷：皂苷是很强的表面活性剂，即使高度稀释也能形成皂液。皂苷对心脏有刺激作用，又是很强的溶血剂。多聚甲醛：渗透能力强，固定均匀，组织收缩小，染色效果好，防止和尽量减少制片过程中人为的溶解和丢失。0.001％TritonX-100：TritonX-100细胞裂解液是一种经典的快速裂解细胞组织并获得蛋白的裂解液。并维持原有的蛋白间相互作用。溶血素优选地pH值是5.0-8.0，如果pH值太低或太高，会对白细胞有所破坏。本专利技术的EDTApH值是7.4，较为稳定。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了前面所述的溶血素的配制方法，所述配制方法包括如下步骤：(1)配置100ml1.5％多聚甲醛；(2)配置好的100ml1.5％多聚甲醛中加入TritonX-100使TritonX-100浓度0.001％；(3)配置好的溶液中加入0.05克皂角苷，使充分溶解即可。根据上述配制方法获得的溶血素包括以下组分：5％(w/v)皂角苷，0.001％(v/v)TritonX-100，1.5％(v/v)多聚甲醛。根据本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了一种流式细胞仪检测专用溶血方法，所述方法包括如下步骤：按照10:1体积比将稀释的前面所述的溶血素加入到抗凝的外周血中，迅速震荡均匀，室温孵育20-30min，使红细胞完全溶解，保留白细胞，用于流式细胞仪检测。进一步，本专利技术提供的上述流式细胞仪检测专用溶血方法的步骤包括：(1)取外周血样本，加入抗凝剂后室温存放，在24h内使用；(2)取抗凝外周血100μl放入流式管中；(3)加入相应的荧光抗体并混合均匀，室温避光孵育20-30分钟；(4)加入1*前面所述的溶血素1ml并迅速震荡均匀，室温放置5-10分钟。根据本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了一种白细胞分群计数的方法，所述方法包括如下步骤：(1)按照前面所述的溶血方法进行溶血；(2)离心，去除上清液；(3)加入细胞染色缓冲液洗涤，离心，去除上清液；(4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改良型溶血素，其特征在于，所述溶血素包括以下组分：皂角苷、多聚甲醛、Triton X‑100。

【技术特征摘要】
1.一种改良型溶血素，其特征在于，所述溶血素包括以下组分：皂角苷、多聚甲醛、TritonX-100。2.一种改良型溶血素，其特征在于，所述溶血素包括以下组分：5％(w/v)皂角苷，0.001％(v/v)TritonX-100，1.5％(v/v)多聚甲醛。3.一种权利要求1或2所述的溶血素的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)配置多聚甲醛溶液；(2)配置好的多聚甲醛溶液中加入TritonX-100；(3)步骤(2)的溶液中加入皂角苷，充分溶解；优选地，所述方法包括如下步骤：(1)配置100ml1.5％多聚甲醛；(2)配置好的100ml1.5％多聚甲醛中加入TritonX-100使TritonX-100浓度0.001％；(3)配置好的溶液中加入0.05克皂角苷，充分溶解。4.一种流式细胞仪检测专用溶血方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：按照10:1体积比将稀释的权利要求1或2所述的溶血素加入到抗凝的外周血中，迅速震荡均匀，室温孵育20-30min，使红细胞完全溶解，保留白细胞，用于流式细胞仪检测；优选地，所述方法包括如下步骤：(1)取外周血样本，加入抗凝剂后室温存放用；(2)取抗凝外周血100μl放入流式管中；(3)加入相应...

【专利技术属性】
技术研发人员：施明，周春保，王福生，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三零二医院，
类型：发明
国别省市：北京,11