一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，为解决目前并无有效方法可对带纹条鳎和角鳎进行快速准确地鉴定，而仅基于传统的形态学观察其生物形态特征容易导致种类鉴定及系统进化上的混乱等问题，本发明专利技术提供了一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法。本发明专利技术所提供的引物可以高效和特异地扩增带纹条鳎和角鳎的ITS1‑5.8S‑ITS2 rDNA序列，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点，且引物在ITS1‑5.8S‑ITS2 rDNA序列扩增后，可直接通过凝胶电泳肉眼观察ITS1的长度异质性对其进行物种鉴别，节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率并且准确度十分高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法
本专利技术涉及分子生物
，尤其涉及一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法。
技术介绍
带纹条鳎和角鳎同属鲽形目鳎科，形态上非常相近，主要通过眼间隔处有无鳞片、尾部斑点颜色进行区分。但是由于其离水后斑点颜色很容易发生变化，且鳞片也很容易脱落，导致两者很难基于传统的形态学进行鉴定，因而导致种类鉴定及系统进化上的混乱。核糖体ITS区域(ITS1-5.8S-ITS2)是一段位于核糖体RNA编码基因18SrDNA和28SrDNA中间的一段基因，包括两段非编码区(ITS1和ITS2)和一段编码区(5.8SrDNA)，其进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的ITS长度差异非常明显。
技术实现思路
为解决目前并无有效方法可对带纹条鳎和角鳎进行快速准确地鉴定，而仅基于传统的形态学观察其生物形态特征容易导致种类鉴定及系统进化上的混乱等问题，本专利技术提供了一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法。其首先要实现对引物快速有效地设计和制备的目的，并通过该引物实现对带纹条鳎和角鳎进行快速有效的鉴定的目的。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物，所述用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物中正向引物为SEQIDNO.1：5’-TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA-3’，反向引物为SEQIDNO.2：5’-GCTCTTCCCTCTTCACTCG-3’。一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物的设计方法，所述方法为：Genbank数据库中下载带纹条鳎和角鳎的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的18SrDNA和28SrDNA上设计引物，扩增出两种形态非常接近的鳎类ITS1-5.8S-ITS2序列。一种上述引物的应用方法，所述引物可用于对带纹条鳎和角鳎的鉴定。作为优选，所述鉴定包括以下步骤：1)DNA抽提试剂盒法提取待测带纹条鳎和角鳎的rDNA；2)采用权利要求1中所述的引物，并以待测带纹条鳎和角鳎的rDNA作为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；3)对扩增产物进行凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，对回收得到的扩增片段进行观察和鉴定。作为优选，步骤1)所述提取rDNA时为避免肠道内容物污染，舍去其头颈部，仅从其尾部提取rDNA。作为优选，步骤2)所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的rDNA模板溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。作为优选，步骤3)所述凝胶电泳采用1.0％琼脂糖凝胶进行。作为优选，步骤3)所述的观察可通过直接肉眼观察进行，并比较所回收的扩增片段长度进行快速鉴定。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术所提供的用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物可以高效和特异地扩增带纹条鳎和角鳎的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点；2)本专利技术所提供的用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物在ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列扩增后，可直接通过凝胶电泳肉眼观察ITS1的长度异质性对其进行物种鉴别，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率并且准确度十分高。附图说明图1为本专利技术实施例中进行凝胶电泳后所得图谱；图中，M为DL2000，1为带纹条鳎，2为角鳎。具体实施方式以下结合具体实施例和说明书附图对本专利技术作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本专利技术。此外，下述说明中涉及到的本专利技术的实施例通常仅是本专利技术一分部的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。实施例引物的制备：S1)Genbank数据库中下载带纹条鳎和角鳎的rDNA序列；S2)对下载得到的rDNA序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域；S3)在两端保守的18SrDNA和28SrDNA上设计引物，扩增出两种形态非常接近的鳎类ITS1-5.8S-ITS2序列，其所得引物为正向引物SEQIDNO.1：5’-TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA-3’；反向引物SEQIDNO.2：5’-GCTCTTCCCTCTTCACTCG-3’。利用上述制备得到的引物对带纹条鳎和角鳎进行扩增和鉴定，其具体步骤如下：1)带纹条鳎和角鳎的采集、鉴定和保存本实施例中所用的带纹条鳎和角鳎样品均采自野外自然环境中，并在其形态学特征消失前对其进行种类确定，所采样品均带回实验室制成标本并进行信息登记。种类鉴定完成的带纹条鳎和角鳎样品用100％的纯酒精浸泡并保存于4℃的冰箱中备用；2)带纹条鳎和角鳎的DNA提取采用DNA抽提试剂盒法提取待测带纹条鳎和角鳎的rDNA，为避免肠道内容物污染，舍去其头颈部，仅从其尾部提取rDNA，rDNA提取直接采用DNA提取试剂盒进行，提取得到的带纹条鳎和角鳎的rDNA保存于-20℃条件下备用；3)PCR扩增PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的rDNA模板溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存扩增产物；4)PCR扩增产物的观察和鉴定PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳，所扩增的片段均采用试剂盒法割胶回收，对回收所得的扩增产物进行肉眼观察，可通过其扩增产物的形态来进行准确快捷的判定，如图1所示，图1中1为带纹条鳎，2为角鳎，其差异十分明显，可通过肉眼观察直接判定。对半滑舌鳎进行测序，其测序结果为SEQIDNO.3：5’-TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTAGTGAGGTCCTCGGATCGGCCCCGCCGGGGTCGGTCACGGCCCTGGCGGAGCGCCGAGAAGACGATCAAACTTGACTATCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGCGCGCCAGGCGGGTGGCCCCCGCAACCCGGCCTGCGCGAGACCCCCGGACGCTTAGGGCGCCCCCGGCGCCCGAGGTGAGCGGTTGGGGCGCGACCCCCTCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物，其特征在于，所述用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物中正向引物为SEQ ID NO.1：5’‑TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA‑3’，反向引物为SEQ ID NO.2：5’‑GCTCTTCCCTCTTCACTCG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物，其特征在于，所述用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物中正向引物为SEQIDNO.1：5’-TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA-3’，反向引物为SEQIDNO.2：5’-GCTCTTCCCTCTTCACTCG-3’。2.一种如权利要求1所述的用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物的设计方法，其特征在于，所述方法为：Genbank数据库中下载带纹条鳎和角鳎的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的18SrDNA和28SrDNA上设计引物，扩增出两种形态非常接近的鳎类ITS1-5.8S-ITS2序列。3.一种如权利要求1所述引物的应用方法，其特征在于，所述引物可用于对带纹条鳎和角鳎的鉴定。4.根据权利要求3所述的一种应用方法，其特征在于，所述鉴定包括以下步骤：1)DNA抽提试剂盒法提取待测带纹条鳎和角鳎的rDNA；2)采用权利要求1中所述的引物，并以待测带纹条鳎和角鳎的rDNA作为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；3)对扩增产...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚理，孔晓瑜，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33