本发明专利技术公开了用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用。本发明专利技术成功筛选并合成15对荧光标记卫星引物，该引物可应用于穿山甲亲子鉴定，也可制备成用于穿山甲亲子鉴定的试剂盒，或进行穿山甲种质鉴定和家系管理，从而合理的指导穿山甲人工繁育工作，为保护穿山甲的遗传多样性，种群遗传机构等研究提供了强有力的工具。本发明专利技术还提供一种穿山甲亲子鉴定的方法，该方法中采用添加M13接头，仅需合成一个M13荧光标记引物进行PCR扩展，从而节省了合成大量荧光引物所花费的成本和时间。
【技术实现步骤摘要】
用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用
本专利技术涉及动物亲子鉴定技术物领域，具体涉及用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用。
技术介绍
穿山甲是一种神秘的具有非典型形态特征的哺乳动物，隶属于哺乳纲(Mammalia)鳞甲目(Pholidota)穿山甲科(Manidae)穿山甲属(Manis)。长期以来，人们对穿山甲鳞片的药用需求，导致穿山甲的非法贸易日益严重，加上其栖息地大规模的破坏，使得穿山甲的野生种群数量急剧下降，目前现存8个种类(GaubertandAntunes,2005；Zhangetal.,2015)均被列入濒危野生动物国际贸易保护名录(ConventiononinternationaltradeinendangeredspeciesofwildfaunaandfloraI,CITESI)。目前，栖息地的片段化和种群孤立化使得处于小种群的穿山甲极易发生近亲繁殖，致使其种质退化、生长性能和繁殖能力下降等问题十分突出。而且穿山甲的繁殖率较低，小种群中个体数量骤减后难以恢复，这些彼此隔离的小种群极易在局部地区灭绝。虽然就地保护是濒危物种保护工作的重要组成部分，但是为了扩大现生种群的规模、增加遗传多样性，人工繁育和迁地保护已经成为保护濒危物种的重要措施。穿山甲在人工饲养的条件下，可以保证获得全面的、充足的食物和营养，得到良好的健康保障，避免天敌伤害。因此，建立一个稳定的人工饲养种群，避免近交繁殖衰退和遗传漂变，增加有效种群大小，以采取与亲缘关系最小的个体进行长期基因交流为目的的选育及优化配对工作显得尤为重要。这样既可以满足国内外进行科学研究和公众教育的社会需求，又可以为圈养繁殖个体释放以补充野生种群创造一定的条件。早期的亲子鉴定将血型或酶型等作为遗传标记。目前，DNA分子标记已经取代了传统的遗传标记，成为亲子鉴定研究中使用的重要遗传标记。微卫星标记由于其多态性丰富，序列两端呈现相对保守的单拷贝序列，等位基因数目高度可变，杂合度高，遗传稳定性较好，呈共显性遗传，因此被广泛的应用于构建基因图谱、遗传关系的确定、个体或群体亲缘关系鉴定之中。微卫星DNA(Microsatellite)又称为简单重复序列(SimpleSequencesRepeats,SSR)，是指一类重复单位在2-6个碱基的重复序列。SSR分子标记具有多态性高、共显性遗传、选择中性、易于操作等优点，获得结果可靠、方法简单、省时省力，很快发展成为一种极具价值的遗传标记，并被广泛的应用于个体间亲子关系鉴定、种群遗传分析、遗传疾病的诊断、基因定位、遗传图谱等研究领域。目前，还没有将微卫星分子标记应用到穿山甲亲子鉴定和遗传管理的报道，本专利技术旨在利用微卫星荧光标记建立马来穿山甲亲子鉴定技术，为解决穿山甲育种过程中，因小种群交配、不同亲本混养而导致的个体识别困难，谱系不清等难题，为穿山甲养殖场建立其家系谱系提供科学依据，以期合理的指导穿山甲人工种群的繁育保育工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物，该引物可用于穿山甲亲子鉴定。本专利技术的另外一个目的在于提供用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物的应用，包括利用该引物对穿山甲进行亲子鉴定，或利用该引物制备成用于穿山甲亲子鉴定的试剂盒。本专利技术通过以下技术方案来实现：根据穿山甲多组织混合样本获得其转录组，根据转录组数据中提供的微卫星位点设计引物；然后以穿山甲唾液样本DNA为模板，使用微卫星标记引物进行PCR扩增，初步筛选PCR产物的多态性，获得多态性高的微卫星标记引物；将多态性高的微卫星标记引物进行FAM荧光修饰，以穿山甲唾液样本DNA为模板，进行PCR分析，对PCR产物进行基因型判定；根据基因型分析结果联合使用排除法与似然法进行亲子关系的鉴定。具体的，用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物，包括：M13MJ-F2F:TTTCATACCGGGAAGTCCAC；R:ATGGTCCTAACACCACGGAG；M13MJ-F3F:CACCTGCATGTACCCCTTTT；R:CCCCCTCAAAATACCACCTT；M13MJ-F4F:GAGAGAAAGGGGAAAATCGG；R:TGATAGGATGTGAGGAGGGG；M13MJ-F5F:TGGGGTCTGCTGTTTTCATT；R:CTCCCTCTGTAGGTTGCCCT；M13MJ-F7F:AGAAGTGATTTGCACCCCTG；R:CAGTGGCCAGAATGGAGATT；M13MJ-F8F:GTCATGCATGGAAGACAGGA；R:GTCTGGCTGAAATGGAAAGG；M13MJ-F9F:CCCTATGAGGTGGGCACTAA；R:AACTCCATCAAAGGTGTGGC；M13MJ-F10F:CCCAGATCCAAAATGAATGG；R:TGCTGATGTTCACTCTTGCC；M13MJ-F11F:ATCCACCTAGGAACCTCAGC；R:GACTCTTCGGGATTTCACACA；M13MJ-F12F:ATCCACCTAGGAACCTCAGC；R:GACTCTTCGGGATTTCACACA；M13MJ-F16F:TTCCCTTCATCTGTTTTGCC；R:CAGCACTGCCAAGGTCTGTA；M13MJ-F17F:GTAATGGGGTATGTGGTGGG；R:TCCCTGTTCAAACGGAATTT；M13MJ-F20F:CAGTGCTCATCACATAGCAGG；R:CATGCCTAGTGTTTCACGTTGM13MJ-F24F:TTCAGCCAGGGTCTCTCAGT；R:TGGGGTTTTTCCTCAATCTG；M13MJ-F25F:CCAGAGAAAGGTAGGAGCCA；R:TCCAGAAAACAGACCCAAGG。进一步的，对以上引物对正向5’端连接M13接头，合成5’端加M13接头的正向引物，M13接头序列为CACGACGTTGTAAAACGAC；对通用引物M13的正向5’端连接荧光基团，合成荧光基团修饰的M13正向引物，所述的通用引物M13的正向引物序列为CACGACGTTGTAAAACGAC。所述的荧光基团为FAM。本专利技术的用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物的应用，包括利用该引物进行穿山甲亲子鉴定，或利用该引物制备成用于穿山甲亲子鉴定的试剂盒，或利用该引物进行种质鉴定和家系管理。一种穿山甲亲子鉴定的方法，包括以下步骤：A、合成上述15个引物对(M13MJ-F2、M13MJ-F3、M13MJ-F4、M13MJ-F5、M13MJ-F7、M13MJ-F8、M13MJ-F9、M13MJ-F10、M13MJ-F11、M13MJ-F12、M13MJ-F16、M13MJ-F17、M13MJ-F20、M13MJ-F24、M13MJ-F25)正向5’端加M13接头的正向引物，所述的M13接头序列为CACGACGTTGTAAAACGAC；合成通用引物M13的正向5’端添加荧光基团的正向引物；所述的通用引物M13的正向引物序列为CACGACGTTGTAAAACGAC。B、提取穿山甲DNA作为模板，使用上述15个引物对正向5’端加M13接头的正向引物、反向引物、通用引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物，包括：M13MJ‑F2 F:TTTCATACCGGGAAGTCCAC；R:ATGGTCCTAACACCACGGAG；M13MJ‑F3 F:CACCTGCATGTACCCCTTTT；R:CCCCCTCAAAATACCACCTT；M13MJ‑F4 F:GAGAGAAAGGGGAAAATCGG；R:TGATAGGATGTGAGGAGGGG；M13MJ‑F5 F:TGGGGTCTGCTGTTTTCATT；R:CTCCCTCTGTAGGTTGCCCT；M13MJ‑F7 F:AGAAGTGATTTGCACCCCTG；R:CAGTGGCCAGAATGGAGATT；M13MJ‑F8 F:GTCATGCATGGAAGACAGGA；R:GTCTGGCTGAAATGGAAAGG；M13MJ‑F9 F:CCCTATGAGGTGGGCACTAA；R:AACTCCATCAAAGGTGTGGC；M13MJ‑F10 F:CCCAGATCCAAAATGAATGG；R:TGCTGATGTTCACTCTTGCC；M13MJ‑F11 F:ATCCACCTAGGAACCTCAGC；R:GACTCTTCGGGATTTCACACA；M13MJ‑F12 F:ATCCACCTAGGAACCTCAGC；R:GACTCTTCGGGATTTCACACA；M13MJ‑F16 F:TTCCCTTCATCTGTTTTGCC；R:CAGCACTGCCAAGGTCTGTA；M13MJ‑F17 F:GTAATGGGGTATGTGGTGGG；R:TCCCTGTTCAAACGGAATTT；M13MJ‑F20 F:CAGTGCTCATCACATAGCAGG；R:CATGCCTAGTGTTTCACGTTGM13MJ‑F24 F:TTCAGCCAGGGTCTCTCAGT；R:TGGGGTTTTTCCTCAATCTG；M13MJ‑F25 F:CCAGAGAAAGGTAGGAGCCA；R:TCCAGAAAACAGACCCAAGG。...
【技术特征摘要】
1.用于穿山甲亲子鉴定的SSR荧光标记引物，包括：M13MJ-F2F:TTTCATACCGGGAAGTCCAC；R:ATGGTCCTAACACCACGGAG；M13MJ-F3F:CACCTGCATGTACCCCTTTT；R:CCCCCTCAAAATACCACCTT；M13MJ-F4F:GAGAGAAAGGGGAAAATCGG；R:TGATAGGATGTGAGGAGGGG；M13MJ-F5F:TGGGGTCTGCTGTTTTCATT；R:CTCCCTCTGTAGGTTGCCCT；M13MJ-F7F:AGAAGTGATTTGCACCCCTG；R:CAGTGGCCAGAATGGAGATT；M13MJ-F8F:GTCATGCATGGAAGACAGGA；R:GTCTGGCTGAAATGGAAAGG；M13MJ-F9F:CCCTATGAGGTGGGCACTAA；R:AACTCCATCAAAGGTGTGGC；M13MJ-F10F:CCCAGATCCAAAATGAATGG；R:TGCTGATGTTCACTCTTGCC；M13MJ-F11F:ATCCACCTAGGAACCTCAGC；R:GACTCTTCGGGATTTCACACA；M13MJ-F12F:ATCCACCTAGGAACCTCAGC；R:GACTCTTCGGGATTTCACACA；M13MJ-F16F:TTCCCTTCATCTGTTTTGCC；R:CAGCACTGCCAAGGTCTGTA；M13MJ-F17F:GTAATGGGGTATGTGGTGGG；R:TCCCTGTTCAAACGGAATTT；M13MJ-F20F:CAGTGCT...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金平，李慧明，李林妙，晋学君，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
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