一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法技术

本发明专利技术提供了一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法：RNA样品脱磷酸化；再通过T4 RNA连接酶，连接脱磷酸化的RNA与DNA接头1，捕捉95%以上的RNA；之后用去甲基化酶减少RNA修饰；再去除多余的接头1；然后以上述RNA为模板逆转录得到cDNA；再降解RNA模板；通过T4 DNA连接酶连接cDNA与发卡结构的DNA接头2，连接98%以上cDNA；再去除多余的接头2；最后进行PCR引物扩增并测序。本发明专利技术通过特殊设计DNA接头，克服了现有RNA测序技术中连接效率偏好性导致的无法精确定量，以及无法捕捉含有修饰位点的RNA分子的缺陷，实现了能够实现对不同来源的RNA样品中所有RNA分子进行绝对定量。本发明专利技术的方法简便，可用于临床分子诊断、分子生物学研究、细菌抗药性、癌症发生及预防等领域。

A High Throughput Sequencing Method for Absolute Quantitative RNA Molecule

The invention provides a high-throughput sequencing method for absolutely quantitative RNA molecule: RNA sample dephosphorylation; then through T4 RNA ligase, the dephosphorylated RNA and DNA junction 1 are connected to capture more than 95% of RNA; after that, RNA modification is reduced by demethylase; then the redundant junction 1 is removed; then the RNA is used as template for reverse transcription to obtain the DNA; the RNA template is degraded again; and the T4 DN is used to capture more than 95% of RNA. A ligase links the DNA junction 2 of the DNA and hairpin structure, linking more than 98% of the DNA; then removes the excess junction 2; finally, PCR primers are amplified and sequenced. The invention overcomes the defects of inaccurate quantification caused by the preferred connection efficiency in the existing RNA sequencing technology and inability to capture RNA molecules containing modified sites by specially designed DNA junctions, and achieves the absolute quantification of all RNA molecules in RNA samples from different sources. The method of the invention is simple and can be used in the fields of clinical molecular diagnosis, molecular biology research, bacterial resistance, cancer occurrence and prevention, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法
本专利技术属于分子生物学与生物医药领域，涉及一种用于对RNA分子进行绝对定量的方法，具体涉及一种测定样品中RNA分子拷贝数的高通量测序方法。
技术介绍
随着分子生物技术的发展，现代生物学和生物医学研究已经进入到“组学”的研究阶段，即通过捕捉细胞内数以千万计的分子动态信息，研究细胞内全局代谢网络和运行机制，如功能基因组学，蛋白组学，代谢组学等。其中，作为遗传信息的传递者，RNA分子在细胞内的其他诸多功能也逐渐被揭示，如调控基因表达、生物催化、调控蛋白翻译效率、细胞抗药性等。随着新一代测序技术（NGS，高通量测序）的发展，RNA高通量测序成为RNA组学研究领域的重要手段，即同时监测细胞内所有RNA分子的动态过程，进而揭示细胞内RNA分子的代谢网络及其作用机理。然而，目前的常规RNA测序技术不能用于RNA分子的绝对定量分析，有两个原因：首先，研究表明，用于RNA测序的连接酶对RNA的序列具有偏好性，不同3’端序列的RNA分子的连接效率差异103倍以上，这种差异在后期测序过程中会被放大到106倍，因此目前的RNA测序技术只能用于不同样品间的相对比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）RNA样品脱磷酸化；（2）通过T4 RNA连接酶连接步骤（1）获得的RNA与特殊设计的DNA接头1；（3）利用去甲基化酶减少RNA修饰；（4）去除多余的DNA接头1；（5）以步骤（4）中的RNA为模板逆转录得到cDNA；（6）降解RNA模板；（7）通过T4 DNA连接酶连接步骤（6）获得的cDNA与特殊设计的DNA接头2；（8）去除多余的DNA接头2；（9）利用NGS测序进行标准PCR引物扩增并测序；所述DNA接头1的序列如SEQ No. 1所示，其3’端碱基为双脱氧核苷酸；DNA接头2的序列如SEQ No. 2...

【技术特征摘要】
1.一种对RNA分子进行绝对定量的高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）RNA样品脱磷酸化；（2）通过T4RNA连接酶连接步骤（1）获得的RNA与特殊设计的DNA接头1；（3）利用去甲基化酶减少RNA修饰；（4）去除多余的DNA接头1；（5）以步骤（4）中的RNA为模板逆转录得到cDNA；（6）降解RNA模板；（7）通过T4DNA连接酶连接步骤（6）获得的cDNA与特殊设计的DNA接头2；（8）去除多余的DNA接头2；（9）利用NGS测序进行标准PCR引物扩增并测序；所述DNA接头1的序列如SEQNo.1所示，其3’端碱基为双脱氧核苷酸；DNA接头2的序列如SEQNo.2所示，其5’端磷硫酰化修饰，其3’端修饰丙烷；逆转录的引物序列如SEQNo.3所示，5’端含有6个磷硫酰化修饰。2.根据权利要求1所述的高通量测序方法，其特征在于，步骤（2）中...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹博，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37