一种化学-酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法技术

本发明专利技术公开了一种化学‑酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法，首先基于SAM在QCM金芯片表面构建ATRP引发剂Br‑单分子层，然后采用SI‑ATRP在QCM金表面构建多羟基聚合物刷POEGMA，并BF3‑Et2O的催化作用下将MOA接枝到POEGMA上构建麦芽糖‑糖基受体单分子层，最后进行酶催化多糖延伸得到支化葡聚糖刷。本发明专利技术不仅简单高效的生产出人造糖被，还通过加入酶催化的方法使得该制备方法相较于传统化学合成法更加绿色环保，相较于化学法制备出的糖基具有构型一定的优点。并且避免了传统方法无法形成三维结构的缺点，在酶的催化下多糖延伸成3D结构，产生了相较于2D结构更高密度的糖基。

A Chemical-Enzymatic Method for Preparing Comb-like Glycosylated Polymer Brushes

The invention discloses a method for preparing comb-like glycosylated polymer brushes by chemical-enzymatic method. Firstly, an ATRP initiator Br_monolayer is constructed on the surface of QCM gold chip based on SAM, then a polyhydroxy polymer brush POEGMA is constructed on the surface of QCM gold by SI_ATRP, and MOA is grafted onto POEGMA under the catalysis of BF3_Et2O to construct a maltose_glycosyl receptor monolayer, and finally enzymatic catalysis. The branched dextran brush is obtained by extending the polysaccharide. The invention not only produces artificial sugar quilt simply and efficiently, but also makes the preparation method greener and more environmentally friendly by adding enzymatic catalysis, and has certain advantages over the sugar group prepared by chemical synthesis. It avoids the disadvantage of traditional methods that can not form three-dimensional structure. Under the catalysis of enzymes, polysaccharides extend into three-dimensional structure, resulting in a higher density of glycosyl group than that of two-dimensional structure.

【技术实现步骤摘要】
一种化学-酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法
本专利技术属于糖科学
，具体涉及一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法。
技术介绍
糖被是覆盖在许多细胞和细菌外部的富含碳水化合物的涂层。广泛的研究表明，糖被不仅可以屏蔽细胞壁直接暴露于侵略者，而且可以调控细胞与周围环境的分子识别。在这些实际功能中，碳水化合物与蛋白质之间的特异性相互作用被证明是细胞过程的一个必要的先决条件。通过研究碳水化合物-蛋白质相互作用，在植入装置上构建仿生糖被以模拟自然界中的糖被被认为是最有效的工具。糖基化聚合物刷是结构上最接近糖被的仿生材料。糖基化聚合物刷是一类化学结构及功能上模拟“糖被”的仿生功能材料，其按化学微结构不同分为线型和梳状。其中梳状糖基化聚合物刷与细胞表面的聚糖在结构上更接近，其单位空间内糖基数目更多且构型更复杂，从而有利于实现糖基“集簇效应”，极大地增强“糖-蛋白质”间结合和识别专一性。因此，构建梳状糖基化聚合物刷进而研究其与蛋白质的识别作用，在更深层次揭示生命体中聚糖的生理功效，及开发新型糖基化仿生功能材料在医学检测、生物亲和分离、表面抗污染、组织工程等领域应用具有重要意义。现有技术中单纯的化学催化法无位点/立构选择性、副反应多，糖苷构型混杂，与天然“糖被”整齐的糖基构型存在很大差距，不利于深层次揭示聚糖的生物学功能；此外，聚合过程中所用重金属催化剂易残留，不利于糖基化聚合物刷在生物医用领域的应用。而酶法虽然绿色环保但通常只实用于特定的酶，所用的酶大多来源有限，价格昂贵；而酶催化底物供体通常为活性糖苷（核苷酸-糖苷或磷酸基-糖苷），合成步骤繁琐、提纯麻烦、价格昂贵，并且不稳定。传统的化学法和酶法都有各自的优缺点，但是简单的将他们组合在一起也并不能轻易实现。比如一般酶法选择的聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)能特异性吸附糖苷酶(来源于苦杏仁的p-葡萄糖苷酶(Glu,EC3.2.1.21)和来源于米曲霉的p-半乳糖苷酶(Gal,EC3.2.1.23)),并对酶活性造成抑制。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术提供一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法，结合两种聚合技术，即表面引发的原子转移自由基聚合（SI-ATRP）和多糖的酶催化延伸（ECE），用于在金表面上制备作为仿生糖被的稠密分支糖基聚合物刷，然后密集填充支化糖基聚合物刷作为人造糖被，并对所构建的仿生糖被进行特异性识别性能进行检测，本专利技术加入酶催化的方法使得该制备方法相较于传统化学合成法更加绿色环保，且相较于化学法制备出的糖基具有构型一定的优点。为进一步揭示聚糖生物学功能提供强有力的技术支持。独特的酶催化法还使得其制备的仿生糖被拥有高于2D结构的3D高密度糖基。本专利技术采用的技术方案为：一种化学-酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法，包括如下步骤：1）将金芯片在氮气流下用乙醇冲洗，随后浸入氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中，最后用超纯水和乙醇冲洗后，在稳定的氮气流下干燥，备用；2）将步骤1）中金芯片浸入11-巯基-1-十一醇乙醇溶液中，随后放入含三乙胺的二氯甲烷中，加入溴代异丁基酰溴进行反应，反应结束后用二氯曱烷、乙醇、超纯水洗涤，高纯氮气吹干备用；3）将步骤2）中金芯片加入甲基丙烯酸酯、CuCl、CuBr2、联吡啶和超纯水混合液中反应，反应结束后用流水冲洗过夜去除可能吸附的有机物，最后用高纯氮气吹干备用；4）将步骤3）中金芯片浸入含八乙酰麦芽糖酯的无水二氯甲烷中，加入三氟化乙醚作为催化剂反应，反应完成后依次用二氯甲院、乙醇、超纯水洗涤金芯片，并用高纯氮气吹干，随后将芯片放入甲醇钠-乙醇溶液中进行脱乙酸基反应，反应结束后用大量超纯水洗涤芯片，并用高纯氮气吹干备用；5）将步骤4）中金芯片放入含葡聚糖蔗糖酶的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应，随后放入含蔗糖的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应，反应结束后超纯水洗涤金芯片，并用超纯氮气吹干，真空储存。步骤1）中氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中三种物质体积比为1:1~2:5~10，浸入时间为10~15min。步骤2）中11-巯基-1-十一醇乙醇溶液浓度为1mM，二氯甲烷中三乙胺浓度为0.06M~0.08M，反应时间为5~10min。步骤3）中甲基丙烯酸酯为10.0~20.0mL，CuCl0.30~0.60mmol、CuBr20.05~0.10mmol、BPY0.50~0.80mmol，反应时间为10~60min。步骤4）中八乙酰麦芽糖酯浓度为20g/L，无水二氯甲烷加入量5~10mL，催化剂BF3EtO2加入量为50~100μL，前期冰水浴中反应2h，随后室温下反应12~36h。步骤4）中甲醇钠-乙醇溶液浓度为5mg/mL，脱乙酸基反应时间为60~120min。步骤5）中蔗糖浓度为0~25mM，在含DSase及含蔗糖的乙酸-乙酸钠溶液中在25℃下温育2~3h。氨水的质量浓度为28%，过氧化氢的质量浓度为30%。本专利技术首先基于SAM在QCM金芯片表面构建ATRP引发剂Br-单分子层，然后采用SI-ATRP在QCM金表面构建多羟基聚合物刷POEGMA，并BF3-Et2O的催化作用下将MOA接枝到POEGMA上构建麦芽糖-糖基受体单分子层，最后进行酶催化多糖延伸得到支化葡聚糖刷，专利技术原理如图1所示。本专利技术寻找到了合适的化学法和酶法来结合以达到互补的效果，聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯(POEGMA)与糖苷酶的相互作用较弱且不会对酶活性造成抑制,因此是糖苷酶表面催化用较优糖基受体。本专利技术构建得到的梳状糖基化聚合物刷与细胞表面的聚糖在结构上更接近，其单位空间内糖基数目更多且构型更复杂，从而有利于实现糖基“集簇效应”，极大地增强“糖-蛋白质”间结合和识别专一性。因此，构建梳状糖基化聚合物刷进而研究其与蛋白质的识别作用，在更深层次揭示生命体中聚糖的生理功效，及开发新型糖基化仿生功能材料在医学检测、生物亲和分离、表面抗污染、组织工程等领域应用具有重要意义。多糖的酶催化延伸（ECE）是实现梳状结构的主要技术。有益效果：通过SI-ATRP将密集包装的线性甲基丙烯酸聚乙二醇酯（POEGMA）链接枝在金表面上，然后通过糖苷键将麦芽糖锚定到POEGMA刷上，构建麦芽糖-糖基受体单分子层，随后在Dsase的作用下使蔗糖底物延伸有效形成支化糖共聚物刷。本专利技术不仅简单高效的生产出人造糖被，还通过加入酶催化的方法使得该制备方法相较于传统化学合成法更加绿色环保，相较于化学法制备出的糖基具有构型一定的优点。并且避免了传统方法无法形成三维结构的缺点，在酶的催化下多糖延伸成3D结构，产生了相较于2D结构更高密度的糖基。附图说明图1为实施例1的原理图。图2为不同支化糖被共聚物刷的XPS图谱；（a）POEGMA刷，（b）MOA-a-POEGMA，（c）麦芽糖-α-POEGMA，（d）葡聚糖-α-POEGMA的测量XPS谱。图3为实施例1的数据图；其中（a）POEGMA和麦芽糖固定的PEGMA刷上DSase催化伸长的典型QCM曲线；（b）蔗糖浓度对麦芽糖锚定的POEGMA刷子的酶促伸长的影响；（c）初始伸长率（ν0）对蔗糖浓度的依赖性；（d）v0相对于蔗糖浓度的倒数图（先将DSase的0.78pmol∙cm-2限制在刷子上）。图4为C1s的高分辨率XPS光谱；其中：（a）POEGM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学‑酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）将金芯片在氮气流下用乙醇冲洗，随后浸入氨水‑过氧化氢‑超纯水的混合物中，最后用超纯水和乙醇冲洗后，在稳定的氮气流下干燥，备用；2）将步骤1）中金芯片浸入11‑巯基‑1‑十一醇乙醇溶液中，随后放入含三乙胺的二氯甲烷中，加入溴代异丁基酰溴进行反应，反应结束后用二氯曱烷、乙醇、超纯水洗涤，高纯氮气吹干备用；3）将步骤2）中金芯片加入甲基丙烯酸酯、CuCl、CuBr2、联吡啶和超纯水混合液中反应，反应结束后用流水冲洗过夜去除可能吸附的有机物，最后用高纯氮气吹干备用；4）将步骤3）中金芯片浸入含八乙酰麦芽糖酯的无水二氯甲烷中，加入三氟化乙醚作为催化剂反应，反应完成后依次用二氯甲院、乙醇、超纯水洗涤金芯片，并用高纯氮气吹干，随后将芯片放入甲醇钠‑乙醇溶液中进行脱乙酸基反应，反应结束后用大量超纯水洗涤芯片，并用高纯氮气吹干备用；5）将步骤4）中金芯片放入含葡聚糖蔗糖酶的乙酸‑乙酸钠溶液中进行反应，随后放入含蔗糖的乙酸‑乙酸钠溶液中进行反应，反应结束后超纯水洗涤金芯片，并用超纯氮气吹干，真空储存。

【技术特征摘要】
1.一种化学-酶法制备梳状糖基化聚合物刷的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）将金芯片在氮气流下用乙醇冲洗，随后浸入氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中，最后用超纯水和乙醇冲洗后，在稳定的氮气流下干燥，备用；2）将步骤1）中金芯片浸入11-巯基-1-十一醇乙醇溶液中，随后放入含三乙胺的二氯甲烷中，加入溴代异丁基酰溴进行反应，反应结束后用二氯曱烷、乙醇、超纯水洗涤，高纯氮气吹干备用；3）将步骤2）中金芯片加入甲基丙烯酸酯、CuCl、CuBr2、联吡啶和超纯水混合液中反应，反应结束后用流水冲洗过夜去除可能吸附的有机物，最后用高纯氮气吹干备用；4）将步骤3）中金芯片浸入含八乙酰麦芽糖酯的无水二氯甲烷中，加入三氟化乙醚作为催化剂反应，反应完成后依次用二氯甲院、乙醇、超纯水洗涤金芯片，并用高纯氮气吹干，随后将芯片放入甲醇钠-乙醇溶液中进行脱乙酸基反应，反应结束后用大量超纯水洗涤芯片，并用高纯氮气吹干备用；5）将步骤4）中金芯片放入含葡聚糖蔗糖酶的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应，随后放入含蔗糖的乙酸-乙酸钠溶液中进行反应，反应结束后超纯水洗涤金芯片，并用超纯氮气吹干，真空储存。2.根据权利要求1所述的一种化学-酶制备梳状糖基化聚合物刷的方法，其特征在于，步骤1）中氨水-过氧化氢-超纯水的混合物中三种物质体积比为1:1~2:5~10，浸入时间为10~15min。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：方艳，何婷，姜岷，马江锋，信丰学，董维亮，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32