一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。该探针分子式为C40H36N7O4

A fluorescent probe for hydrogen sulfide and its preparation method and Application

The invention discloses a hydrogen sulfide fluorescent probe, a preparation method and application thereof. The molecular formula of the probe is C40H36N7O4.

【技术实现步骤摘要】
一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种硫化氢荧光探针其制备方法和应用，属于硫化氢探针的制备

技术介绍
硫化氢是一种无机化合物，正常情况下是一种无色、易燃的酸性气体，浓度低时带恶臭，气味如臭蛋；浓度高时反而没有气味(因为高浓度的硫化氢可以麻痹嗅觉神经)。它能溶于水，是一种弱酸，当它受热时，硫化氢又从水里逸出。硫化氢(H2S)是继一氧化碳和一氧化氮之后，第三种可在生命体内发挥生理作用的内源性气体信号分子。硫化氢是一种急性剧毒，吸入少量高浓度硫化氢可于短时间内致命。低浓度接触仅有呼吸道及眼的局部刺激作用，高浓度时全身作用较明显，表现为中枢神经系统症状和窒息症状。该气体分子在心血管和神经系统中担负着重要的生理病理调节作用。因此，设计并合成特异性好、灵敏度高、并具有良好的生物相容性的荧光探针，能够实时准确地对生物体内的硫化氢浓度进行检测和成像对于疾病的预防、诊断、检测、治疗以及病理生理的深入研究都具有重要的指导意义。目前，主要通过分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等检测手段来检测硫化氢。这些方法一般适用于检测水溶液和食品中的硫化氢，并不适于生物环境的硫化氢的检测，因为它们的检测灵敏度有限并且对生物样品具有破坏性。近年来，小分子有机荧光探针受到科学界的广泛关注，它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变化，以达到检测目的。利用荧光探针的荧光分析法具有特异选择性、高灵敏度、响应时间快等特征，并且对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测可以实时在线，形象具体地观察到信号变化。所以，专利技术能快速检测、易观查信号变化的硫化氢荧光探针是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能快速区分检测低浓度硫化氢和高浓度硫化氢的荧光探针，并进一步提供了该探针的制备方法和应用。本专利技术采用以下技术方案：一种硫化氢荧光探针，其分子式为C40H36N7O4+，具有如下所示结构：本专利技术的硫化氢荧光探针，对硫化氢的响应时间为20分钟左右。所述响应时间为：本专利技术的硫化氢荧光探针作用于含有硫化氢的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到稳定所需时间。本专利技术的硫化氢荧光探针，能抗异亮氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，CH3COO-，TBNP，Cys，GSH，Hcy，NO，Al3+，Cu2+，Ca2+，K+，NO3-，Na+，Zn2+，ONOO-，CO32-，OH-，PO43-，SCN-，SO42-，H2O2的干扰，特异性好。本专利技术所述硫化氢荧光探针的制备方法，包括如下步骤：(1)将溴代萘酸酐1.81mmol溶解于5mlDMF中，随后加入9mmolNaN3，在N2保护下避光90℃加热回流搅拌反应2小时；然后加水抽滤得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：(2)称取1mmol步骤(1)所得化合物2溶于6ml乙醇中，随后加入2mmolbete-氨基丙酸，避光80℃加热回流搅拌反应2h，然后除去反应液中的乙醇得到化合物3，化合物3的结构式如下所示：(3)将1mmol8-羟基久洛尼定-9-甲醛溶于4ml98％的浓硫酸中，随后加入1mmol对呱嗪苯乙酰，90℃加热回流搅拌反应6小时反应完毕后，加入冰水和高氯酸得到大量沉淀，减压抽滤将溶剂除去得到粗产品；以体积比为40:1的乙酸乙酯与甲醇为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物4，化合物4的结构式如下所示：(4)称取0.1mmol步骤(2)所得化合物3、0.2mmol步骤(3)所得化合物4、0.2mmolEDCI和0.01mmolHOBT于容器，加入3ml二氯甲烷溶解，然后在避光常温和搅拌条件下反应6小时以上，得到化合物5，化合物5即为本专利技术所述探针，化合物5的结构式如下所示：上述制备方法中，优选的：步骤(2)在使用化合物2之前，可以用硅胶层析柱以纯二氯甲烷为洗脱剂进一步纯化；用旋转蒸发仪除去二氯甲烷；步骤(4)在使用化合物3之前，可以用硅胶层析柱以体积比为20:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂进一步纯化；步骤(5)中，所得化合物5即本专利技术所述探针，可以用硅胶层析柱以体积比为30:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂进一步纯化。本专利技术所述探针的合成路线如下：化合物5即为本专利技术所述探针。本专利技术所述的硫化氢荧光探针，可应用于检测水环境中的硫化氢和生物样品的硫化氢。上述应用，具体的，包括：观察加入硫化氢荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化；荧光激发波长为445nm；或者，在365nm光源照射下，用肉眼观察加入硫化氢荧光探针前后待测水环境的荧光变化；或者，观察加入硫化氢荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。所述生物环境，可以是活细胞，且为离体生物组织细胞。所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，在535nm和650nm处的荧光峰值的变化；如果535nm处峰值和650nm处峰值变大，则说明含有少量硫化氢；如果535nm处峰值变小且650nm处峰值变大，则说明含有大量硫化氢。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。所述荧光成像图的变化是指：加少量硫化氢时，从观察到无绿色荧光到观察到有绿色荧光，从观察到有微弱的红色荧光到观察到强的红色荧光。加入大量硫化氢时，从观察到红色荧光到观察到无红色荧光，从观察到微弱的绿色荧光到观察到很强的绿色荧光。上述应用，具体的，包括以下步骤：(1)将探针溶于DMF，制成探针母液；(2)将探针母液加入到待测液中；用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，在535nm和650nm处的荧光峰值的变化；如果535nm处峰值和650nm处峰值变大，则说明含有少量硫化氢；如果535nm处峰值变小且650nm处峰值变大，则说明含有大量硫化氢。其中，荧光光谱仪激发波长为445nm；或者，在365nm光源照射下，待测液的荧光由红色荧光变为黄色荧光，则说明含有硫化氢；将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜，使用激发波长为405nm的光源激发，收集500-550nm范围的荧光；观察到绿色荧光，收集673-735nm范围的荧光；观察到红色荧光，则说明含有少量硫化氢。只收集500-550nm范围的荧光；观察到绿色荧光，则说明含有大量硫化氢。首先，水溶液中的硫化氢可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的硫化氢含量，从而定量检测。其次，通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针和硫化氢的活细胞进行荧光成像，观察绿色和红色通道荧光信号的变化以达到比值检测生物环境中的硫化氢的目的。另外，利用本专利技术的探针，采用荧光光谱仪测试水溶液的硫化氢时，在20分钟左右荧光光谱的峰值达到稳定；具备反应时间短的优势，实现了快速检测。本专利技术的优点：(1)探针合成简单，并且产率较高；(2)本专利技术实现了水溶液中硫化氢的特异性和快速检测；(3)本专利技术实现了活细胞水平中硫化氢的检测。附图说明图1是实施例1中探针的1HNMR图谱；图2是实施例1中探针的13CNMR图谱；图3是实施例2中探针随不同量硫化氢的加入荧光谱图的变化情况；图中，硫化氢浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μmol/L的荧光光谱；图4是实施例2中探针随不同量硫化氢的加入荧光谱图的变化情况；图中，硫化氢浓度依次为100、150、20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硫化氢荧光探针，其特征在于，其分子式为C40H36N7O4+，具有如下所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种硫化氢荧光探针，其特征在于，其分子式为C40H36N7O4+，具有如下所示结构：2.一种权利要求1所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将溴代萘酸酐1.81mmol溶解于5mlDMF中，随后加入9mmolNaN3，在N2保护下避光90℃加热至回流搅拌反应2小时；然后加水抽滤得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：(2)称取1mmol步骤(1)所得化合物2溶于6ml乙醇中，随后加入2mmolbete-氨基丙酸，避光80℃加热回流搅拌反应2h，然后除去反应液中的乙醇得到化合物3，化合物3的结构式如下所示：(3)将1mmol8-羟基久洛尼定-9-甲醛溶于4ml98％的浓硫酸中，随后加入1mmol对呱嗪苯乙酰，90℃加热回流搅拌反应6小时，反应完毕后，加入冰水和高氯酸得到大量沉淀，减压抽滤将溶剂除去得到粗产品；以体积比为40:1的乙酸乙酯与甲醇为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物4，化合物4的结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，杨云真，何隆薇，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37