基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用，属于生物传感技术领域。将CdS QDs修饰到与miRNA部分互补的发卡DNA的一端，CdS QDs对光电化学材料g‑C3N4起到敏化作用。目标miRNA与其互补链的杂交配对形成刚性双螺旋结构后，CdS QDs远离g‑C3N4表面，使得CdS QDs对g‑C3N4的敏化作用减弱，导致阳极流向阴极的电子减少，引起PEFC的开路电压变化，实现miRNA的检测。该传感器检测过程中无需额外供电设备、组装简单方便、成本低廉、抗干扰能力强，DNA链的互补配对效应使该传感器具有高选择性，可实现miRNA简单、快速、灵敏、高效检测。

Self-powered microRNA biosensor based on PEFC and its application

The invention relates to a self-powered microRNA biosensor based on PEFC and its application, belonging to the field of biosensor technology. CdS QDs can sensitize the photoelectrochemical material g C3N4 by modifying the end of hairpin DNA which is partially complementary to the microRNA. After the hybrid pairing of target microRNAs and their complementary chains forms a rigid double helix structure, CdS QDs are far away from the surface of G C3N4, which weakens the sensitivity of CdS QDs to G C3N4, reduces the electrons flowing from the anode to the cathode, causes the change of open circuit voltage of PEFC, and realizes the detection of microRNAs. The sensor has no additional power supply equipment, simple assembly, low cost and strong anti-interference ability. The complementary pairing effect of DNA chains makes the sensor highly selective. It can realize the simple, fast, sensitive and efficient detection of microRNAs.

【技术实现步骤摘要】
基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用
本专利技术涉及一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用，属于生物传感

技术介绍
光电生物燃料电池(PEFC)是一种特殊的燃料电池，其能在温和条件下，利用光激发提供可持续能源，受到广泛关注。基于PEFC的自供能生物传感器，是一种以电池性能输出作为分析检测信号的一类传感器，该传感器信号与被检测分析污浓度成比例关系。与传统传感器相比，光电自供能生物传感器检测过程中无需施加额外电源，其具体优点主要表现在：(1)设备简单。检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，仅需两根电极，即PEFC的阴阳两极，便可实现检测；(2)抗干扰能力强。测试体系未施加额外电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；(3)能实现简单、快速、实时检测。检测过程中无需电化学工作站等供电设备，仅需简易电压表和适宜的光源便可实现检测，故检测设备易携带，能实现实时监测。MicroRNA(miRNA)，约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，在多种生物过程如细胞分化、凋亡、增殖和免疫反应中具有重要作用，已成为用于检测多种癌症的诊断和预后评估的新生物标志物。目前，检测miRNA表达的方法主要有Northern印迹法、miRNA阵列和实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、电化学方法。Northern印迹法灵敏度低、费时费力、样品需求量大。微阵列检测法同样存在灵敏度较低的缺点，并且特异性较弱。RT-PCR具有高特异性与高灵敏度，但该方法操作繁琐、RNA需分离纯化。miRNA小尺寸的特点也限制了传统RT-PCR的直接应用，并且miRNA家庭成员之间高的序列同源性也使定量分析成为挑战。因此，设计制备基于生物燃料电池的自供能生物传感器，实现miRNA简单、方便、高灵敏、高特异性检测非常必要。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述缺陷，本专利技术构建了基于PEFC的miRNA生物传感器，核心技术便为PEFC的构建，其中以氧化石墨烯/碳纳米管/金纳米粒子(GO/CNTs/AuNPs)作为laccase的载体，构建生物阴极催化氧气；以AuNPs-g-C3N4作为光阳极检测miRNA。首先将与miRNA部分互补的发卡DNA固定到电极表面，发卡DNA一端连接电极表面，一端修饰CdSQDs。当无目标miRNA时，由于发卡DNA没有被打开，CdSQDs靠近电极表面对g-C3N4起到敏化作用，此时阳极光电流较大，流向阴极的电子较多，电池输出电压高；当目标miRNA存在时，由于miRNA打开发卡DNA，目标miRNA与互补链形成刚性双螺旋结构，使CdSQDs远离g-C3N4表面，CdSQDs对g-C3N4敏化作用减弱。目标miRNA的引入，达到使CdSQDs远离电极表面的目的，流向阴极的电子减少，电压输出信号减小，用于定量检测目标miRNA。本专利技术设计的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，可实现目标物简单、快速、灵敏、高效检测。本专利技术是采用以下的技术方案实现的：一种基于PEFC的自供能生物传感器，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH7.4的0.1MPB缓冲体系。所述AuNPs-g-C3N4光阳极的制备方法如图1所示，包括如下步骤：步骤A：将三聚氰胺与尿素按质量比1:1混合，置于管式炉中，以2～8℃/min升温至500～1000℃后维持2～5h，获得的黄色块状固体即为C3N4，研磨至粉末备用；步骤B：取一定量的步骤A中制得的C3N4，加入到100～200mL、5～10M的HNO3中100～200℃回流8～16h，将回流得到的白色产物8000～15000rpm多次离心洗涤至中性，将得到的洗涤液在3000～8000rpm下离心10～30min，取上清液得到白色泛蓝胶体，即为剥离好的g-C3N4纳米片；步骤C：取2～8mL步骤B中制得的剥离好的g-C3N4纳米片溶解在4～8mL二次水中并超声0.5～1h，将20～50μL的HAuCl4在搅拌条件下加入到上述溶液中，超声10～30min，在室温下搅拌0.5～1h，重复加入三次HAuCl4，将100～200μL、0.01～0.1M新配制的NaBH4快速加入到上述溶液中，持续搅拌10～30min，将100～500μL、0.01～0.05M的柠檬酸钠逐滴加入到上述溶液中，持续搅拌10～40min，之后将上述溶液5000～10000rpm离心10～30min，二次水清洗一次，得到的沉淀分散于4～8mL二次水中，得到AuNPs-g-C3N4混合物；步骤D：将20～50μL步骤C中制得的AuNPs-g-C3N4滴涂在ITO电极表面，二次水冲洗后，置于4℃下备用。所述GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极的制备方法，包括如下步骤：步骤Ⅰ：取一定量的GO分散在10～20mL二次水中，超声1～2h，再取一定量的CNTs，加入到溶解完全的GO悬浮液中，继续超声2～4h，取一定量的40～100nM的AuNPs加入到上述溶液中继续超声2～4h得到均匀悬浊液，将上述得到的悬浊液至于反应釜中150～300℃反应2～5h，得到GO/CNT/AuNPs；步骤Ⅱ：取一定量步骤Ⅰ中制得的GO/CNT/AuNPs超声溶解于二次水中，将20～50μL制得的GO/CNT/AuNPs溶液滴涂在ITO电极表面，37℃下干燥2～4h；步骤Ⅲ：滴涂10～50μL、10～50mg/mL的laccase溶液于步骤Ⅱ中得到的GO/CNT/AuNPs电极表面，37℃下干燥12～24h，二次水冲洗后，置于4℃下备用。一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH7.4的0.1MPB缓冲体系。所述AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极的制备方法，包括如下步骤：将20～50μL发卡DNA滴涂到修饰有AuNPs-g-C3N4的ITO电极表面4～8℃孵育8～12h，二次水冲洗电极表面；向修饰有发卡DNA的电极表面滴加20～50μL含有20～40mMEDC及10～20mMNHS的CdS-COOHQDs溶液，室温下反应1～2h后，二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加20～50μL、1～3mM的MCH溶液，室温孵育1～3h，进行封板，二次水冲洗电极表面，得到AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极。一种如上述所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器的应用，将其用于检测miRNA。所述检测方法包括如下步骤：步骤(1)：将AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极、GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极、含0.1M葡萄糖pH7.4的0.1MPB缓冲体系组装为电池，测量电池的EOCV，记为E0OCV；步骤(2)：向AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/Cd本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PEFC的自供能生物传感器，其特征在于，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs‑g‑C3N4光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH 7.4的0.1M PB缓冲体系。

【技术特征摘要】
1.一种基于PEFC的自供能生物传感器，其特征在于，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH7.4的0.1MPB缓冲体系。2.一种基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，包括阳极、阴极和电解液；所述阳极为AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极，所述阴极为GO/CNT/AuNPs/laccase生物阴极，所述电解液为含0.1M葡萄糖pH7.4的0.1MPB缓冲体系。3.根据权利要求2所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极的制备方法包括如下步骤：将发卡DNA滴涂到修饰有AuNPs-g-C3N4的ITO电极表面，一次孵育，二次水冲洗电极表面；向修饰有发卡DNA的电极表面滴加含有EDC及NHS的CdS-COOHQDs溶液，反应，二次水冲洗电极表面，向电极表面滴加MCH溶液，二次孵育，二次水冲洗电极表面，得到AuNPs-g-C3N4/HS-DNA-NH2/MCH/CdS光阳极。4.根据权利要求3所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述发卡DNA的滴涂量为20～50μL。5.根据权利要求3所述的基于PEFC的自供能miRNA生物传感器，其特征在于，所述CdS-COOHQDs溶液为20～50μL含有20～40mMEDC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李峰，盖盼盼，张淑霞，刘晓娟，侯婷，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37