本发明专利技术属于农业微生物应用技术领域，具体涉及对几种病原细菌具有抑菌活性的苏云金芽胞杆菌及其细菌素。所述的苏云金芽胞杆菌XY66，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018124。本发明专利技术的苏云金芽胞杆菌能产生一种新型细菌素，申请人将该细菌素命名为苏云金菌素。本发明专利技术的苏云金菌素的分子量为4,347.93Da，其前体肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1中1‑144碱基位的序列所示。本发明专利技术分离鉴定的苏云金菌素对多种病原细菌如肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌及蜡样芽胞杆菌具有高效抑菌活性。
Bacillus thuringiensis and its bacteriocins with bacteriostatic activity against several pathogenic bacteria
The invention belongs to the technical field of agricultural microorganism application, in particular to Bacillus thuringiensis and its bacteriocins, which have bacteriostatic activity against several pathogenic bacteria. The Bacillus thuringiensis XY66 is stored in a typical culture preservation center in China with the preservation number CCTCC NO:M 2018124. The Bacillus thuringiensis of the invention can produce a new bacteriocin, which is named by the applicant as Bacillus thuringiensis. The molecular weight of Thuringiensin of the present invention is 4,347.93 Da, and the amino acid sequence of its precursor peptide is shown as the sequence of 1 144 base in SEQ ID NO:1. The Thuringin isolated and identified by the invention has high bacteriostatic activity against various pathogenic bacteria such as Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes and Bacillus cereus.
【技术实现步骤摘要】
对几种病原细菌具有抑菌活性的苏云金芽胞杆菌及其细菌素
本专利技术属于微生物应用领域，具体涉及对几种病原细菌具有抑菌活性的苏云金芽胞杆菌及其细菌素。所述的苏云金芽胞杆菌菌株为XY66，申请人将分离的细菌素类物质命名为苏云金菌素。
技术介绍
抗生素的发现和应用为人类的健康做出了巨大贡献，与此同时由抗生素滥用而导致的细菌耐药性问题也日趋严重。目前寻找新型、高效的抑菌物质来应对抗生素耐药性问题迫在眉睫(Czaplewskietal.,2016)。细菌素是细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽类物质，具有高效的抑菌活性，对人体或动物无毒，能被动物消化道中的一些蛋白酶所降解，具有很好的选择性杀菌效果、易于生物改造和强热稳定性以及耐酸碱能力等特点，是一种良好的抗生素替代品(Cotteretal.,2013)。苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是一类广泛存在于土壤中的、多种农业害虫具有高效特异的杀虫活性的革兰氏阳性细菌。目前Bt已开发成为目前世界上产量最大、应用最广泛的最成功的活菌类生物杀虫剂(Bravoetal.,2011)。而随着研究的深入，目前发现Bt除了可以产生杀虫晶体蛋白外还产生丰富多样的次级代谢产物，而细菌素就是其中一种。目前在Bt中已报道了一些细菌素，如在BtDPC6431中发现的细菌素ThuricinCD对艰难梭菌具有高效、专一的抑菌活性，且在人体结肠模型下不会破坏肠道菌群的结构，在未来可能成为人类对抗艰难梭菌感染的新药物(Reaetal.,2010)。另外专利申请人也在Bt4BT1中鉴定了1种新型双组份羊毛硫细菌素Thusin，它对多种革兰氏阳性病原细菌具有高效的抑菌活性，具有成为新型抗菌药物剂的应用潜力(Xinetal.,2016)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一株对几种病原细菌具有抑菌活性的苏云金芽胞杆菌及其细菌素。本专利技术包括苏云金芽胞杆菌新菌株及其所产细菌素，苏云金芽胞杆菌新菌株及其所产的细菌素对几种病原菌具有高效抑菌活性。本专利技术通过以下方案实现：申请人分离、筛选得到一株对几种病原菌具有抑菌活性的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株，将所得的菌株命名为苏云金芽胞杆菌XY66，BacillusthuringiensisXY66，于2018年3月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(即CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2018124。苏云金芽胞杆菌XY66菌株具有以下特性：(1)苏云金芽胞杆菌XY66菌株可产生对多种病原细菌(如肺炎链球菌(代表菌株为ATCC49619)，单核细胞增生李斯特菌(代表菌株为LM201，CMCC54002)和蜡样芽胞杆菌(代表菌株为ATCC14579))具有抑菌活性的物质。(2)苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的抑菌活性物质为一新型的细菌素，该细菌素类物质申请人将其命名为苏云金菌素。该苏云金菌素的分子量是4,347.93Da(在单一同位素模式下测定)。所述的苏云金菌素的前体肽合成的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，其中在SEQIDNO:1所示序列的第1-144位的序列是该序列的编码区，其对应氨基酸为该1-144位碱基所示的序列，编码47个氨基酸残基，该苏云金菌素的前体肽的蛋白质序列如序列表SEQIDNO:2所示。苏云金菌素的合成基因簇的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。(3)苏云金菌素对多种革兰氏阳性病原细菌(如肺炎链球菌ATCC49619，单核细胞增生李斯特菌CMCC54002，单核细胞增生李斯特菌LM201和蜡样芽胞杆菌ATCC14579)具有抑菌活性。本专利技术的分离的苏云金芽胞杆菌(Bacilluscereus)菌株XY66的微生物菌学特征如下：菌体大小为1～1.2μm×3～5μm，细胞呈杆状，芽胞中生，革兰氏染色呈阳性反应。在LB固体培养基上可形成表面粗糙、质地软且不规则的淡黄色菌落。最适生长温度为28℃，pH6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。本专利技术的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株XY66可以按照常规甘油管保藏方法保藏。更详细的技术方案参见《具体实施方式》的描述。附图说明序列表SEQIDNO:1是本专利技术筛选的苏云金芽胞杆菌XY66菌株分泌的细菌素，即苏云金菌素的前体肽的核苷酸序列。序列长度为144bp。其中在SEQIDNO:1所示序列的第1-144位的序列是苏云金菌素的前体肽的编码区(即CDS，其中该序列的第141-143位的TAA三个碱基不翻译氨基酸)，共编码47个氨基酸残基。序列表SEQIDNO:2是苏云金菌素的前体肽的蛋白质序列。SEQIDNO:3是苏云金菌素的合成基因簇的核苷酸序列。序列长度为6533bp。SEQIDNO:4是苏云金芽胞杆菌XY66菌株的16SrRNA序列。序列长度为1493bp。图1：苏云金芽胞杆菌XY66菌株的菌落形态。图2：苏云金芽胞杆菌XY66菌株生长至稳定期的发酵上清对肺炎链球菌，单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的抑菌活性检测结果。附图标记说明：图2中的A图是肺炎链球菌ATCC49619的抑菌活性检测结果；图2中的B图是单核细胞增生李斯特菌CMCC54002的抑菌活性检测结果；图2中的C图是单核细胞增生李斯特菌LM201的抑菌活性检测结果；图2中的D图是蜡样芽胞杆菌ATCC14579的抑菌活性检测结果。图3：苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的细菌素，即苏云金菌素的HPLC分析结果。图4：苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的细菌素，即苏云金菌素的质谱分析结果。图5：苏云金芽胞杆菌XY66菌株产生的细菌素，即苏云金菌素的N端测序分析结果。图6：苏云金菌素的前体肽序列、成熟肽序列和合成基因簇的示意图。附图标记说明：图6中的A图是苏云金菌素的前体肽序列；图6中的B图是苏云金菌素的成熟肽序列；图6中的C图是苏云金菌素的合成基因簇。图7：苏云金菌素对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的抑菌活性的检测结果。附图标记说明：图7中的A图是肺炎链球菌ATCC49619菌株的抑菌活性检测结果；图7中的B图是单核细胞增生李斯特菌CMCC54002的抑菌活性检测结果；图7中的C图是单核细胞增生李斯特菌LM201菌株的抑菌活性检测结果；图7中的D图是蜡样芽胞杆菌ATCC14579菌株的抑菌活性检测结果。具体实施方式实施例1一、苏云金芽胞杆菌XY66菌株的分离、鉴定及抑菌活性的检测1、土壤中对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特氏菌及蜡样芽胞杆菌具有抑菌活性的芽胞杆菌的筛选(1)土壤中芽胞杆菌的分离与筛选称取中国湖北省武汉市华中农业大学试验农场的1g土壤，在超净台中将土壤加入到称有LB-NaAc培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，醋酸钠34.02g，补充蒸馏水至1L，pH为7.0，121℃灭菌30min)的250mL的三角瓶中，30℃，220rpm/min摇床培养4h。培养4h后将三角瓶置于80℃水浴3min。待三角瓶冷却后，在超净台中用移液枪吸取100μL培养液涂布于Luria-Bertamedium(LB)固体培养基(配方：蛋白胨10g，酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌及蜡样芽胞杆菌具有抑菌活性的一株苏云金芽胞杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)XY66，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018124。
【技术特征摘要】
1.对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌及蜡样芽胞杆菌具有抑菌活性的一株苏云金芽胞杆菌菌株(Bacillusthuringiensis)XY66，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018124。2.如权利要求1所述的对肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌及蜡样芽胞杆菌具有抑菌活性的一株苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)XY66，该菌株分泌苏云金菌素。3.一株分泌苏云金菌素的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株XY66，保藏在中国典型培养物...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，信丙越，郑金水，彭东海，阮丽芳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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