一株枯草芽孢杆菌菌株及其在降解油桐饼粕蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株枯草芽孢杆菌菌株，所述短杆菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60153，保藏日期为2017年3月28日，命名为枯草芽孢杆菌LYT‑1。该菌株可用于制备降解油桐饼粕制剂，制备油桐饼粕发酵菌剂，制备抗病原真菌制剂。

A Bacillus subtilis strain and its application in degrading Tung cake protein

The invention discloses a strain of Bacillus subtilis, which is stored in the microbial strain Preservation Center of Guangdong Province. The preservation number is GDMCC No. 60153 and the preservation date is March 28, 2017. The strain is named Bacillus subtilis LYT_1. The strain can be used to prepare degradable tung oil cake preparation, tung oil cake fermentation agent and anti-pathogenic fungi preparation.

【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽孢杆菌菌株及其在降解油桐饼粕蛋白中的应用
本专利技术属于微生物工程
，具体涉及一株降解油桐饼粕的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
技术介绍
油桐是我国本土的木本油料树种。油桐具有生长快，产量高，适应性广，种子含油率高且营养丰富等优点。桐籽榨油后的桐饼，含有氮4％～6％，P2O51.8％～2.7％，K2O1.2％～1.3％，还有大量其它微量元素，是一种优良的蛋白资源。但由于油桐饼粕含有毒素，为皂角甙和佛波醇及其相关化学物质，因而油桐饼粕长久以来多作为饼肥还田使用。随着农业现代化的发展，高养分且使用简便的化肥逐渐取代了历史悠久的有机肥。随之而来的是各种农业和环境问题：土壤养分流失、肥力下降，环境污染加剧，作物抗病虫害能力减弱，资源浪费等等。桐粕肥料化不仅有助于解决世界各地的肥源不足问题，有益于生物肥的多样性，而且能够在一定程度上规避对于化学肥料的依赖。但是油桐饼粕作为肥料直接施用或者堆积发酵后施用，不仅肥效慢，而且桐粕中的营养物质不能充分利用造成资源浪费。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类革兰氏阳性杆状好氧型细菌，可以产生内生芽孢，其适应能力强，应用性广。并且细菌本身没有致病性，对环境和人畜无害，对抗生素不会产生耐药性。枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多种消化酶，并且在形成芽孢过程中可分泌多种抗生素，对一些植物病害具有拮抗作用。因此，枯草芽孢杆菌是一种理想的生物有机肥和饲料发酵菌种。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一株枯草芽孢杆菌LYT-1及其在降解油桐饼粕中的应用，本专利技术的枯草芽孢杆菌能够耐受油桐饼粕毒素并有效降解油桐饼粕蛋白质。本专利技术所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)命名为枯草芽孢杆菌LYT-1，该菌株已于2017年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，(简称GDMCC，保藏单位地址：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，邮编：510070)，保藏编号为GDMCCNo:60153。本专利技术所提供的枯草芽孢杆菌LYT-1的特征如下：1)菌落特征：菌落呈污白色，圆形和椭圆，表面粗糙且不透明，边缘不整齐。2)革兰氏染色：杆状，呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。3)生理生化鉴定结果如表1所示：表1枯草芽孢杆菌LYT-1生理生化试验结果4)16SrDNA序列分析：本专利技术的枯草芽孢杆菌LYT-1，其16SrDNA序列在NCBI数据库中用BLAST进行同源性分析，得到相似性较高的序列，运用MEGA6.06软件构建系统发育树；该芽孢杆菌LYT-1的16SrDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的同源性达到99％。枯草芽孢杆菌LYT-1具有耐受油桐饼粕毒素的能力。枯草芽孢杆菌LYT-1具有高效降解油桐饼粕蛋白质的能力。枯草芽孢杆菌LYT-1具有抑制植物病原真菌的能力，所述真菌为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)。枯草芽孢杆菌LYT-1具有促生作用，所述促生作用为解磷作用。因此，枯草芽孢杆菌LYT-1可用于制备降解油桐饼粕制剂。还可用于制备油桐饼粕发酵菌剂。还可用于制备抗病原真菌制剂中的应用。总之，本专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌LYT-1，该菌株具有耐受油桐饼粕毒素和高效降解油桐饼粕的能力，并且具有拮抗病原真菌的能力和促生作用。该菌株在96小时内降解油桐饼粕蛋白生产氨基酸量为176.6mg/g，增长了11.1倍。本专利技术提供的枯草芽孢杆菌菌株LYT-1为降解油桐饼粕提供了菌源，具有良好的应用前景。附图说明图1为本专利技术具体实施方式中枯草芽孢杆菌LYT-1的菌落形态图；图2为本专利技术具体实施方式中枯草芽孢杆菌LYT-1的革兰氏染色图；图3为本专利技术具体实施方式中枯草芽孢杆菌LYT-1的PCR产物琼脂糖电泳图；图4为本专利技术具体实施方式中枯草芽孢杆菌LYT-1的16S序列构建的系统发育树图；图5为本专利技术具体实施方式中枯草芽孢杆菌LYT-1平板拮抗亚麻立枯病原菌示意图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本专利技术作更全面、细致地描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本专利技术的保护范围。除非另有特别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例1：菌株的分离和筛选1)油桐饼粕来源：通过从自湖南国盛生物能源股份有限公司采样。2)油桐饼粕浸出汁培养基：油桐饼粕200g，60～90℃下浸泡3～4h，用8层纱布过滤除去残渣获得桐粕汁，定容至1000mL，250mL三角瓶分装，每瓶装量50mL，pH自然。3)油桐饼粕发酵底料：油桐饼粕和水等比例(质量比)混匀，500mL锥形瓶装量40g，1×105Pa灭菌25min(两次)。4)菌种初筛：将油桐饼粕和水按3∶1比例混匀，自然堆积发酵20d。取1g堆积发酵的油桐粕接种到油桐粕浸出汁培养基屮，做3个重复，30℃、180r/min摇床培养48h后，分别吸取1mL菌悬液接种到油桐粕浸出汁培养基屮，30℃、180r/min摇床培养3d。3d后分别取1mL菌悬液，用无菌水作一系列的倍比稀释。分别将100μL稀释浓度为10-13～10-16的稀释液涂布到NA培养基上，30℃培养箱中倒置培养，每隔24h观察平板上菌体生长情况。挑取颜色形态不同的菌落进行划线分离，反复进行纯化，得到单菌落并进行编号，4℃斜面保存。5)菌株复筛：将分离纯化的单菌株分别接种到50mLNA液体培养基中，30℃、180r/min摇床培养。每隔12h时取样1mL，用无菌水进行10-1～10-8倍比稀释，选取10-7～10-8浓度进行NA平板涂布，每个浓度3次重复，30℃恒温培养24h，对平板上的菌落进行计数。待细菌密度达到108CFU/mL时即可用于接种发酵。按40％接种量(V/m)接种菌液到油桐饼粕发酵底料中，35℃恒温培养箱培养4d，每隔24h进行翻样，每个菌株2组重复。发酵结束后，取出发酵物70℃烘干，甲醛法测定发酵前后样品中氨基态氮含量，对比筛选出发酵效果比较好的菌株。6)用直径0.5cm的打孔器将亚麻立枯、油茶炭疽病原菌菌块接种于PDA培养基平板中心，在距平板中央2.5cm十字交叉处等距离接种不同的分离菌，以不接种分离菌为对照，每处理3次重复。25℃培养，对照长满全皿时，记录具备抑菌能力的细菌。实施例2：菌株的鉴定1)形态学观察：将菌株划线到营养琼脂(NA)培养基(胰蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，Ph7.2～7.4，121℃下灭菌20min。)，然后将平板倒转，30℃培养24h，观察记录平板上菌落的生长情况。图1显示菌株的菌落特征大体上如下：菌落特征：菌落呈微黄色，表面粗糙褶皱不透明，圆形或不规则形，边缘不整齐；用试剂盒对其进行革兰氏染色，油镜下进行菌体观察并拍照，图2显示菌株为杆状，呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。2)生理生化鉴定：接触酶实验：直接滴加3％的过氧化氢于菌株的液体培养物(24h)中，立即观察，有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。菌株立即产生大量气泡，实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述短杆菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60153，保藏日期为2017年3月28日，命名为枯草芽孢杆菌LYT‑1。

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述短杆菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:60153，保藏日期为2017年3月28日，命名为枯草芽孢杆菌LYT-1。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株在制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎继烈，赵梦瑞，李培旺，李昌珠，方勤敏，张梦君，吴红，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，湖南省林业科学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43