一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法及应用技术

本发明专利技术属于生物合成技术领域，公开了一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法及应用，利用川贝母内生真菌浸泡液与硝酸银溶液反应，对分离得到的15株川贝母内生真菌进行初筛后，利用川贝母内生真菌CBY4和CBY13通过生物合成法制备纳米银4‑AgNPs和13‑AgNPs；生物合成过程中，合成条件为：pH3‑11，硝酸银溶液浓度为2mmol/L，2000Lux光照强，50℃。本发明专利技术首次发现川贝母中分离的内生真菌CBY4和CBY13具有合成纳米银的能力，优化得到了一个比较适合其纳米银合成的反应条件，同时发现合成的纳米银具有一定的抑菌和抗肿瘤活性。

【技术实现步骤摘要】
一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法及应用
本专利技术属于生物合成
，尤其涉及一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法及应用。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：1、内生真菌的分析现状内生真菌是一类生活于健康植物的组织细胞间或细胞内，且不会造成明显疾病症状的真菌。自1898年vogl等科学家成功地从黑麦草的种子中分离出第一株内生真菌，120年来，关于内生真菌的分析从未间断过，目前内生真菌的分析已经覆盖了整个植物界，不管是常见的低等植物如苔藓、地衣等，还是经济价值高的高等植物如人参、铁皮石斛等。尤其是在1993年，美国蒙大拿州立大学Strobel博士等首次从短叶红豆杉的韧皮部中分离得到1株能合成新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌安德氏紫杉霉Taxomycesandreanae，这项分析结果直接而有力地证明植物内生真菌能够合成与宿主植物相同或相似活性成分。此后植物内生真菌的分离纯化、菌种鉴定、活性检测逐渐成为分析热点。1.1内生真菌的多样性内生真菌广泛存在于整个植物界中，是一个庞大而特殊的真菌类群，相较于其他真菌类群，内生真菌的分析尚处于起步阶段，学界对内生真菌的种类和数量还知之甚少。最初Hawksworth在估算自然界中真菌存在的数量时，并没有将内生真菌计算在内。学者从现已分析过的植物体内都能分离到数量不等的内生真菌，表明内生真菌是普遍存在于植物体内的，数量从十几种到近百种，还从未出现过没有分离得到内生真菌的现象。田小曼等从菊科植物青蒿的根、茎、叶三个不同部位中,成功地分离出12株内生真菌。伍等从两个产区的玄参中成功分离得到58株内生真菌。秦盛等以一种墨西哥仙人掌Opuntiamicrodasys(Lehm.)Pfeiff的肉质茎为材料，从中分离获得31株内生真菌。李治滢等以药用植物乌头的侧根、茎、叶、花为材料，从这四个不同部位中分离获得164株内生真菌[8]。在对内生真菌与宿主进行专一性分析时发现平均每种宿主至少有4-5种专性内生真菌,如果按地球目前己探明存在的25万种植物计算,则整个植物界内生真菌的总数可以超过100万种。1.2内生真菌的作用内生真菌作为一类长期生活在宿主植物体内的真菌类群，在与宿主长期协同进化的过程中形成了特殊的互惠共生关系。一方面宿主植物可以为内生真菌提供生长所需的营养物质和栖息场所，另一方面内生真菌也可以合成一些对宿主植物有利的活性成分。因此内生真菌对宿主植物的生长发育和进化演变起到重要作用。1.2.1促进宿主植物的生长内生真菌具有可以增强植物生长的功能，Behie等发现绿僵菌Metarhiziumrobertsii通过菌丝的作用，为植物宿主提供一种有效的氮转移途径。在绿僵菌的作用下，昆虫体内15个被标记的氮，最后以两种氨基酸的形式出现在菜豆Phaseolusvulgaris和柳枝稷Panicumvirgatum两种植物内，证明绿僵菌能够促进植物对氮元素的吸收利用。明乾良通过实验证明我国重要药用植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.产生的内生真菌D16对丹参毛状根的生长具有明显的促进作用。李会强分析发现多年生黑麦草产生的内生真菌在温室盆栽和田间条件下都能促进宿主植物生长。带内生真菌种群的分蘖数、株高生长速率、分蘖生长速率、叶宽、地上部组织含水量均显著高于不带内生真菌种群和对照种群(P<0.05)，这充分说明内生真菌对多年生黑麦草生长有明显的促进作用,内生真菌带菌率越高,这种促进作用越明显。内生真菌具有可以合成促进植物生长发育的物质的功能，如生长素、赤霉素等。张集慧等选取从兰科药用植物中分离得到的5种内生真菌进行发酵,从真菌发酵液和菌丝体中分别提取植物激素,经分析鉴定其中包含有赤霉素(GA3),吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)5种植物激素，而这些激素对兰科药用植物的生长具有良好的促进作用。1.2.2增强宿主植物的抗逆境和病虫害的能力Waqas等发现拟青霉菌P.formosusLWL1产生的植物激素和有机酸具有缓解粳稻热应激方面的作用，能显著提高植物生长情况,包括株高、鲜重、干重和叶绿素含量，且具有更低的内源性胁迫信号化合物水平及提升的总蛋白量,有利于作物在高温环境下生长的耐受性。宋梅玲通过实验证明带有内生真菌种群的盐生植物野大麦Hordeumbrevisubulatum在盐胁迫条件下种子的发芽率、发芽指数和根苗长、相对含水量以及叶绿素、类胡萝卜素和游离脯氨酸的含量(P<0.05)、SOD、POD和CAT酶活性、营养元素吸收和运输能力均显著高于对照组。Yao等分析表明从山豆根Sophoratonkinensis分离得到的655株内生真菌中有6株菌对三七Panaxnotoginseng的三种病原真菌有显著的抑制活性。1.2.3合成丰富的代谢产物Ludwig-Müller指出植物次生代谢产物的部分或完整的生物合成途径可能与植物体内的内生菌有关，内生菌也可以合成相同的或类似的活性物质。Strobel分析发现从内生真菌中可分离出51％的具有生物活性的新物质,而从土壤微生物仅能分离出38％的新物质。目前已从内生真菌中分离到大量生物活性物质,主要有黄酮、生物碱、醌类、环肽、脂肪酸等化合物,并发现其化学成分具有杀虫、降糖、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性[21]。同时因为内生真菌具备脱离其寄主植物可独立生长的能力,在实验室条件下就可以成功培养存活。因此相较于宿主植物，内生真菌具有个体小、容易培养保藏，发酵周期短，不污染环境等多方面优势，并且可以通过发酵内生真菌来获得大量目的产物。这些优势使得内生真菌成为一种重要的天然药物新来源，也避免植物资源被过度开采，为保护濒危植物资源起到重要作用。Liu等从喜树CamptothecaacuminataDecne.的根、枝、叶和果实中分离出48株内生真菌,采用HPLC法与紫外扫描光谱相结合的方法,得到了类似于喜树碱的紫外光谱和10株能够产生喜树碱的菌株。并进一步对其抗肿瘤活性进行筛选,结果发现7株菌株明显抑制HL-60细胞的体外生长。刘芸等采用组织分离法，通过分离、纯化桃儿七植株根、茎部位的内生真菌,得到一株能产鬼臼毒素的内生真菌Cephalosporiumsp.，采用动物体内抑瘤实验分析该株内生真菌的发酵液对小鼠S180肉瘤有抑制作用,能够促进白细胞和淋巴细胞的增殖。张玲琪等首次分析证明从长春花Catharanthusroseus(L.)茎的韧皮部中分离出的尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum能够产生抗癌药长春新碱成分。1.3川贝母内生真菌的分析现状川贝母为百合科植物川贝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫贝母FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia、甘肃贝母FritillariaprzewalskiiMaxim.、太白贝母FritillariataipaiensisP.Y.Li或瓦布贝母FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsiavar.wabuensis(S.Y.TangetS.C.Yue)Z.D.Liu,S.WangetS.C.chen的干燥鳞茎。具清热本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法，其特征在于，所述川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法包括：利用川贝母内生真菌浸泡液与硝酸银溶液反应，对分离得到的15株川贝母内生真菌进行初筛后，利用川贝母内生真菌CBY4和CBY13通过生物合成法制备纳米银4‑AgNPs和13‑AgNPs；生物合成过程中，合成条件为：pH3‑11，硝酸银溶液浓度为2mmol/L，2000Lux光照强，50℃。

【技术特征摘要】
1.一种川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法，其特征在于，所述川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法包括：利用川贝母内生真菌浸泡液与硝酸银溶液反应，对分离得到的15株川贝母内生真菌进行初筛后，利用川贝母内生真菌CBY4和CBY13通过生物合成法制备纳米银4-AgNPs和13-AgNPs；生物合成过程中，合成条件为：pH3-11，硝酸银溶液浓度为2mmol/L，2000Lux光照强，50℃。2.如权利要求1所述的川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法，其特征在于，所述川贝母内生真菌生物合成纳米银的合成方法进一步包括：(1)内生真菌的发酵菌株活化：从保存菌种的PDA斜面中挑取菌丝接入新鲜配制的PDA平板培养基中，置于生化培养箱中28℃培养3-5d活化；发酵液制备：在活化好的菌株平板边缘用5mm打孔器打取菌饼，把菌饼按照一瓶一菌饼的方式接种到装有PDB的三角瓶中；置于恒温振荡培养箱中28℃，120r/min，振荡培养7d；(2)内生真菌的菌体收集和二次发酵过滤内生真菌发酵液，收集菌体，用去离子水反复洗涤3-4次直至滤过液呈无色；取一定量的菌体浸泡在与原发酵体系相同体积的去离子水中进行二次发酵，28℃，120r/min，振荡培养24h。过滤菌体浸泡液，收集滤液；(3)生物合成纳米银的初筛新鲜配制浓度为1mmol/L的硝酸银溶液，将菌体浸泡液和AgNO3溶液按照9:1的比例进行混合，常温常压条件下静置反应，将未添加AgNO3溶液的等体积浸泡液设为空白对照；反应一段时间后，结合UV-2600紫外可见分光光度计检测纳米银特征吸收峰，判断是否有纳米银合成产生的指标；(4)内生真菌的鉴定。3.如权利要求2所述的川贝母内生真菌介导纳米银的生物合成方法，其特征在于，内生真菌的鉴定包括：a)形态学鉴定：对筛选的菌株CBY4和CBY13进行显微形态特征分析；b)分子生物学鉴定：利用经典的CTAB法提取川贝母内生真菌CBY13的基因组DNA：用无菌接种针挑取约5g左右的湿菌体放入研钵中，加入液氮研磨，将研磨好的细粉转移到50mL的无菌离心管中,储存在-20℃冰箱中过夜。取出样品向无菌离心管中加入15mL缓冲液，再加入3mL5mol的NaCl和2mLCTAB裂解液，65℃孵育45min(，然后37℃孵育15min。加入20mLde氯仿：异戊醇＝24:1混合液；混合均匀，室温放置10min后，12000r/min离心20min，弃去上清液后加入11mL的异丙醇缓混匀；用离心法8000r/min离心10min收集核酸颗粒，将沉淀下来的核酸颗粒用70％的乙醇洗净，自然风干10min；将得到的核酸颗粒悬浮于5mL无菌水中；加入0.5mgDNase-freeRNase，37℃孵育30min；加入5mLde氯仿：异戊醇＝24:1混合液，再加5mL苯酚提取DNA；加入4mL异戊醇沉淀DNA，然后8000r/min离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴卫，邓克莉，苏天骄，陈银银，侯凯，张慧慧，石宪，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51