感染动物的假型MERS-CoV病毒、其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及假型MERS‑CoV病毒包装系统、使用所述假型MERS‑CoV病毒包装系统体外转染细胞来制备假型MERS‑CoV病毒的方法，并涉及在缺乏生物安全水平三级(BSL‑3)设施的生物实验室中使用所述假型MERS‑CoV病毒感染人二肽基肽酶4(hDPP4)基因敲入的小鼠模型，由此评估抗病毒剂和疫苗的体内功效。

【技术实现步骤摘要】
感染动物的假型MERS-CoV病毒、其制备方法和用途
：本专利技术涉及病毒学、基因工程和分子生物学领域。具体地，本专利技术涉及假型MERS-CoV病毒包装系统、使用所述假型MERS-CoV病毒包装系统体外转染细胞来制备假型MERS-CoV病毒的方法，并涉及在缺乏生物安全水平三级(BSL-3)设施的生物实验室中使用所述假型MERS-CoV病毒感染人二肽基肽酶4(hDPP4)基因敲入的小鼠模型，由此评估抗病毒剂和疫苗的体内功效。
技术介绍
大多数感染人类的冠状病毒引起轻度的上呼吸道疾病，但是，2012年6月在中东地区出现的一种与人类严重呼吸系统疾病相关的新型β冠状病毒－中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus(MERS-CoV))(ZakiAM等人，IsolationofanovelcoronavirusfromamanwithpneumoniainSaudiArabia.NEnglJMed，367(19):1814–1820(2012))引起严重的下呼吸道疾病，使患者短期内快速进展为呼吸衰竭。根据WHO的报告，MERS-CoV病毒是冠状病毒科生物安全水平三级(BSL-3)病毒。自2012年9月在沙特阿拉伯首次分离出MERS-CoV病毒以来，在27个国家中已经导致2121例实验室确诊的人类感染病例，其中包括740例相关的死亡病例(约35％死亡率)(参见http://www.who.int/emergencies/mers-cov/en/)。MERS-CoV病毒的流行病学趋势不同于与其基因学上密切相关的重症急性呼吸综合征冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromescoronavirus(SARS-CoV)。SARS-CoV病毒自2005年以来没有进一步的病例报导(L.Du等人,Recombinantreceptor-bindingdomainofSARS-CoVspikeproteinexpressedinmammalian,insectandE.colicellselicitspotentneutralizingantibodyandprotectiveimmunity.Virology393,144-150(2009))，但是，感染MERS-CoV病毒的病例和受感染国家却一直在持续增加。流行病学研究表明，防止MERS-CoV病毒潜在的流行病学状况将是一场漫长且艰难的战斗(G.Zhao等人,Asafeandconvenientpseudovirus-basedinhibitionassaytodetectneutralizingantibodiesandscreenforviralentryinhibitorsagainstthenovelhumancoronavirusMERS-CoV.Virologyjournal10,266(2013))。但是，由于MERS-CoV病毒是生物安全水平三级(BSL-3)病毒，为了保护实验室工作人员和医护人员不被感染、防止该病原微生物扩散出实验室等，必须在生物安全级别至少为BSL-3的设施中操作MERS-CoV病毒。目前，中国仅有少量的BSL-3实验室，其有限的空间和昂贵的运营成本不能满足候选抗病毒剂和疫苗高通量筛选的需求，从而严重限制了抗MERS-CoV病毒剂和疫苗的研发。假型MERS-CoV病毒是经人工设计的一种在体外细胞中包装的病毒，只能感染细胞一次，在体内无法复制，因此具有较高的生物安全性，是一种有用的病毒学工具。人们期待用假型MERS-CoV病毒替代MERS-CoV真病毒在MERS-CoV相关领域的研究中发挥作用。让人感兴趣的是，一些假病毒在体外能有效地模拟真病毒感染宿主细胞的许多过程与特征，特别是一些假病毒能有效地模拟真病毒结合宿主细胞的过程。但是，现有技术中报导的假型MERS-CoV病毒通常具有低的效价，这大大地限制了假型MERS-CoV病毒更广泛的应用。例如，G.Zhao等人(Asafeandconvenientpseudovirus-basedinhibitionassaytodetectneutralizingantibodiesandscreenforviralentryinhibitorsagainstthenovelhumancoronavirusMERS-CoV.Virologyjournal10,266(2013))报导了他们所制备的假型MERS-CoV病毒单周期感染表达作为MERS-CoV病毒受体的二肽基肽酶4(DPP4)的多种细胞，能够用来体外筛选MERS-CoV病毒进入细胞的抑制剂等。然而，G.Zhao等人制备的假型MERS-CoV病毒不能感染已被证明对MERS-CoV真病毒特别敏感的hDPP4基因敲入小鼠。至今为止，由于缺乏具有强感染能力的合适MERS-CoV假病毒，尚没有报导MERS-CoV假病毒感染的动物模型。MERS-CoV病毒对动物感染的相关研究仍是依赖于基于MERS-CoV真病毒的感染而实施。因此，本领域需要开发出一种在缺乏BSL-3设施的生物实验室中可使用的、操作比较安全的高滴度假型MERS-CoV病毒生产系统，其产生的高滴度假型MERS-CoV病毒能够感染hDPP4基因敲入小鼠，由此使得经济实用地评估针对MERS-CoV病毒的抗病毒剂和疫苗的体内功效成为可能。专利技术概述本专利技术提供了一种高滴度假型MERS-CoV病毒生产系统，其包含生产高滴度假型MERS-CoV病毒的宿主细胞和假型MERS-CoV病毒包装系统。本专利技术还提供了产生所述高滴度假型MERS-CoV病毒的方法、以及所述高滴度假型MERS-CoV病毒在hDPP4基因敲入小鼠中评估针对MERS-CoV病毒的抗病毒剂和疫苗的体内功效中的用途。本专利技术的第一方面涉及一种假型MERS-CoV病毒包装系统，其包含包膜基因缺失的HIV骨架质粒和含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒，所述包装系统共转染哺乳动物细胞后能够包装出高滴度的假型MERS-CoV病毒。在一个实施方案中，本专利技术的假型MERS-CoV病毒包装系统包含表达萤光素酶的包膜基因缺失的HIV骨架质粒和含有优化的MERS-Spike蛋白编码序列的表达质粒。在一个实施方案中，本专利技术的假型MERS-CoV病毒包装系统包含一种选自pSG3.Δenv.Fluc、pSG3.Δenv.Fluc.Δnef、pSG3.Δenv.cmvFluc和NTL-3.Fluc.R-.E-的包膜基因缺失的HIV骨架质粒，并包含一种选自pCAG-MERS、pcDNA-MERS、pCMV-MERS和pcDNA-opti-MERS的MERS-Spike蛋白基因表达质粒。本专利技术的第二方面涉及高滴度的假型MERS-CoV病毒，其中MERS-CoVS蛋白有效地掺入包装的HIV颗粒(例如，HIV-1颗粒)中，所述假型MERS-CoV病毒是使用本专利技术第一方面的假型MERS-CoV病毒包装系统共转染哺乳动物细胞后获得的。在一个实施方案中，本专利技术的假型MERS-CoV病毒的滴度在1×105至1×109TCID50/ml之间，能够感染人二肽基肽酶4(hDPP4)基因敲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.假型MERS‑CoV病毒包装系统，其包含包膜基因缺失的HIV骨架质粒和含有MERS‑Spike蛋白基因的表达质粒，所述包装系统共转染哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞、HEK 293T细胞、HEK293FT细胞)后能够包装出高滴度的假型MERS‑CoV病毒，例如滴度高达1×105－1×109TCID50/ml，例如1×107－1×109TCID50/ml，例如，1.27×107.5TCID50/ml的假型MERS‑CoV病毒。

【技术特征摘要】
1.假型MERS-CoV病毒包装系统，其包含包膜基因缺失的HIV骨架质粒和含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒，所述包装系统共转染哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293FT细胞)后能够包装出高滴度的假型MERS-CoV病毒，例如滴度高达1×105－1×109TCID50/ml，例如1×107－1×109TCID50/ml，例如，1.27×107.5TCID50/ml的假型MERS-CoV病毒。2.权利要求1所述的假型MERS-CoV病毒包装系统，其中共转染哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293FT细胞)时使用的包膜基因缺失的HIV骨架质粒与含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒的比率为1:3至4:1，优选地为3:1；优选地，其中假型MERS-CoV病毒包装系统包含一种选自pSG3.Δenv.Fluc、pSG3.Δenv.Fluc.Δnef、pSG3.Δenv.cmvFluc和NTL-3.Fluc.R-.E-的包膜基因缺失的HIV骨架质粒，并包含一种选自pCAG-MERS、pcDNA-MERS、pCMV-MERS和pcDNA-opti-MERS的MERS-Spike蛋白编码序列表达质粒。3.假型MERS-CoV病毒，其中MERS-CoVS蛋白有效地掺入包装的HIV颗粒(例如，HIV-1颗粒)中，所述假病毒是使用权利要求1或2所述的假型MERS-CoV病毒包装系统共转染哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293FT细胞)后获得的。4.宿主细胞，其包含权利要求1或2所述的假型MERS-CoV病毒包装系统，所述宿主细胞经培养后能够生产权利要求3所述的假型MERS-CoV病毒。5.权利要求1或2所述的假型MERS-CoV病毒包装系统、权利要求4所述的宿主细胞的用途，用于制备权利要求3所述的假型MERS-CoV病毒。6.权利要求3所述的假型MERS-CoV病毒的制备方法，包括将权利要求1或2所述的假...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄维金，刘强，王佑春，范昌发，李倩倩，吴曦，刘甦苏，吕建军，杨艳伟，曹愿，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11