一种磷脂酶B及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种磷脂酶B及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用。该磷脂酶B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。培养包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组细胞，从而获得磷脂酶B。将所得磷脂酶B应用于制备甘油磷脂酰胆碱中，解决了磷脂酶B的来源问题，同时较好的解决了磷脂酶B出现的包涵体问题，弥补了现有技术中，单用磷脂酶A1催化中遇到的酰基转移的不足。为工业生产提供了一种可以高效生产甘油磷脂酰胆碱的方法。该方法可以显著的提高酶的催化效率、产品的得率和底物的利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种磷脂酶B及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用
本专利技术属于生物催化技术和磷脂类产品的制备领域，特别涉及一种磷脂酶B及其在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用。
技术介绍
L-a-甘油磷脂酰胆碱（L-a-GPC,CAS号：28319-77-9）是自然界中天然存在的物质，是由磷脂分子上两条脂肪酸链完全被水解的产物，是体内卵磷脂代谢的产物之一。GPC是合成乙酰胆碱神经递质的前体，并能迅速分解磷脂降解的中间体，还可以迅速提供跨大脑血脑屏障的胆碱，被证明能够增强年轻个体的生长激素释放，增加阿兹海默氏症类型老年痴呆症患者的荷尔蒙分泌，如治疗阿兹海默症、小脑性共济失调、精神分裂症、双相情感障碍、神经和精神疾病等，还可以降低血脂、保护血管、改善老年人认知能力和记忆力。这些重要的医药价值和保健价值，使得GPC在医药领域和食品添加剂领域存在巨大的市场需求，但它在自然界中的含量较少，主要存在于动物器官、牛的乳汁和卷心菜中。因此，创建一种高效生产GPC的技术将具有重要的药用、社会和研究价值。早期的GPC主要是从牛的胰脏组织中直接提取制备的，该方法技术及工艺比较基础，获取量相对较低。随着GPC药用、保健、临床价值的研究深入，研究人员发现了越来越多的GPC的制备方法，其中较具代表性的制备方法包括：化学法和生物酶水解法。由于化学法在制备GPC的方法存在部分的环境污染、成本过高、产品纯度低等问题。随着生物技术的发展，生物酶法逐渐成为GPC制备的新型技术，其具有环保、高效的特点，故成为现今GPC制备技术的研究热点。目前已经有专利公开了利用商业化的磷脂酶A1（LecitaseΜltra）在水相体系中制备GPC的研究，但是磷脂酶A1只能专一性的水解Sn-1位的脂肪酸，磷脂酶A2只能专一性的水解Sn-2位的脂肪酸；若单用磷脂酶A1催化PC水解生成GPC，则要先进行一步酰基转移反应，将Sn-2位的脂肪酸转移到Sn-1位上，才能将剩余的脂肪酸全部水解下来。这就使得仅用磷脂酶A1催化生成GPC反应的速率和PC的利用程度非常依赖于中间产物Sn-2-LPC的酰基转移的速率。目前也已经有研究者采用了联合磷脂酶A1和磷脂酶A2的方法催化生产GPC的反应体系，但是由于磷脂酶A2的来源有限且价格昂贵，极大地限制了这种技术的发展。而本研究使用的磷脂酶B，可以同时水解Sn-1位和Sn-2位的脂肪酸。目前磷脂酶B已经从动物、植物、微生物等不同的来源获得。但是动植物磷脂酶B来源有限且价格昂贵。要解决GPC的制备问题，就需要先解决磷脂酶B的来源问题，如何获取一种低廉的磷脂酶B是当今值得研究的问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种磷酸酶B及其在制备甘油磷酸胆碱中的应用，通过构建产磷酸酶B的基因工程菌，发酵菌株，从而获得磷酸酶B，发酵条件简单，为以后工业化生产奠定了基础。一种磷酸酶B，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该磷脂酶B的基因序列来源于荧光假单胞菌（Pseμdomonasflμorescens），其原始基因序列如SEQIDNO.2所示，将SEQIDNO.2所示的基因序列进行适合大肠杆菌表达的密码子优化，形成大量包涵体，无法得到可溶性蛋白，不能用于进一步的催化制备甘油磷脂酰胆碱。一种重组细胞，包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。上述重组细胞的构建方法，将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，得重组质粒；将重组质粒转化宿主菌，即得重组细胞。上述重组细胞的构建方法，具体包括的步骤：第一步，在SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-plb；第二步，将重组质粒pET-28a-plb转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶B的表达菌种BL21（DE3）/pET-28a-plb。上述重组细胞的培养方法，具体步骤如下：1)挑取BL21（DE3）/pET-28a-plb单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养;2)将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2~3小时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，28℃过夜培养。上述磷酸酶B在制备甘油磷脂酰胆碱中的应用。所述应用的步骤如下：向磷酸盐缓冲溶液中加入磷酸胆碱（PC），均质1h至磷酸胆碱（PC）在体系中分散均匀，再加入磷脂酶B粗酶液，使得体系中酶蛋白浓度为1g/L，反应温度为37℃、200r/min振荡反应并定时取样，液相检测GPC的含量。有益效果：本专利技术通过对来源于Pseμdomonasflμorescens的磷脂酶B进行密码子优化得到了可以在大肠杆菌中正常表达的基因序列，并构建了产磷脂酶B的重组大肠杆菌，解决了磷脂酶B的来源问题，同时较好的解决了磷脂酶B出现的包涵体问题，弥补了现有技术中，单用磷脂酶A1催化中遇到的酰基转移的不足。为工业生产提供了一种可以高效生产甘油磷脂酰胆碱的方法。该方法可以显著的提高酶的催化效率、产品的得率和底物的利用率。附图说明图1为本专利技术中重组质粒的构建图；图2为磷脂酶A1和磷脂酶A2作用磷酸胆碱PC的位点的图；图3为磷脂酶B催化磷酸胆碱生成甘油磷脂酰胆碱的反应路径图，其中，1-上清，2-沉淀；图4为30℃时蛋白电泳图，其中，1-上清，2-沉淀；图5为20℃低温诱导蛋白电泳图，其中，1-上清，2-沉淀；图6为分子伴侣共表达蛋白电泳图。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详细介绍。实施例1重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-plb的构建根据已报导的Pseμdomonasflμorescens来源磷脂酶B的氨基酸序列（NCBI登录号：GΜ367870）进行密码子优化后合成该序列，密码子优化后的序列如SEQIDNO.1所示，两端设计酶切位点NcoI和XhoI。上游引物P1：（CATGCCATGGGCATGAAAAAAGTTATGCTG）下游引物P2：（CCGCTCGAGGAAACGGTAGGTAGC），亚克隆到载体PET-28a上，获得重组质粒pET-28a-PLB。将构建好的重组质粒PET-28a-PLB转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶B的表达菌株BL21（DE3）pET-28a-PLB。实施例2培养表达大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-plb挑取表达磷脂酶B的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；再将该菌转接于LB培养基，接种量为LB培养基体积的1-5%，37℃培养2-3小时至OD0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃过夜培养，离心收集表达磷脂酶B的基因工程菌，进行细胞破碎，8000rpm，条件下，离心20min收集上清酶液，随后进行酶活力检测。酶活力检测的检测方法：按照一定比例稀释后的100µL酶液加入到5mL含有蛋黄卵磷脂的PBS缓冲液(pH7.0)中，使蛋黄卵磷脂的终浓度为60g/L，充分混匀后置于40℃水浴锅中反应5min，加入终止剂95%的乙醇，震荡，加入酚酞试剂，然后用NaOH(已知浓度)溶液滴定，观察颜色，确定空白中颜色变色临界点为滴定的终点，将样品滴定终点与空白的颜色保持一致，计算碱液的消耗量；磷脂酶酶活力定义为：一个磷脂酶活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷酸酶B，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种磷酸酶B，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组细胞，其特征在于，包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。3.基于权利要求2所述的一种重组细胞的构建方法，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒上，得重组质粒；再将重组质粒转化宿主菌，即得重组细胞。4.根据权利要求3所述的一种重组细胞的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：第一步，在SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的两端设计酶切位点NcoI和XhoI，亚克隆到载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-plb；第二步，将重组质粒pET-28a-plb转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到磷脂酶B的表达菌种BL21（DE...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，卢媛媛，王昕，李辉，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32