治疗性膜囊泡制造技术

本发明专利技术涉及一种从细胞外囊泡或细胞器中产生膜囊泡的方法和通过此类方法产生的治疗性膜囊泡。本发明专利技术进一步涉及治疗性膜囊泡、通过使用此类囊泡治疗代谢紊乱的方法和用于治疗，如用于治疗代谢紊乱的此类囊泡。本发明专利技术进一步涉及从细胞器中产生膜囊泡的方法。此外，本发明专利技术涉及从细胞外囊泡体中分离细胞外囊泡亚群的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗性膜囊泡
本专利技术涉及膜囊泡的产生的领域，具体地说是治疗性膜囊泡的产生。此外，本专利技术涉及此类膜囊泡用于靶向递送治疗性化合物的治疗用途。
技术介绍
已知外泌体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、微囊泡和凋亡小体等细胞外囊泡由人体内的许多细胞释放，并且可以将功能性RNA分子以及蛋白质穿梭至其它细胞。通过脂质膜双分子层保护这些细胞外囊泡的负荷(cargo)免受细胞外酶和免疫系统的影响。先前已经提出，细胞外囊泡如外泌体可以用于将功能性分子包括治疗性核苷酸递送至患病细胞，如癌细胞、癌组织和炎性细胞。已经提出几种技术用于加载外泌体或微囊泡，用例如用于递送到受体细胞内部的治疗性RNA负荷(Alvarez-ErvitiL.等，《自然生物技术(NatBiotechnol.)》2011年4月；29(4)：341-5；OhnoS.等，《分子治疗(MolTher.)》2013年1月；21(1)：185-91；EP2010663)。所有这些技术的共同点是其利用相对“完整”的囊泡。可以认为囊泡是完整的，因为除了其已经加载有的任何特异性负荷例如siRNA或微小RNA(microRNA)以外，所述囊泡携带其通常携带的分子。虽然此前已经做了很多工作，但细胞外囊泡领域尚未完全探索。此类囊泡的全部治疗性潜力仍有待实现。
技术实现思路
本公开的目的是提供可以用于靶向递送治疗性化合物的新型治疗性膜囊泡。另一目的是在治疗中使用如此提供的囊泡。本公开的目的是提供可以用于靶向递送治疗性化合物的新型治疗性膜囊泡。另一目的是在治疗中使用如此提供的囊泡。本公开的目的是提供产生膜囊泡包括用于治疗用途的那些膜囊泡的新方法。此类方法尤其包括分离特异性膜囊泡和提供具有预定分子含量的膜囊泡的方法。对技术人员而言从本公开中显而易见的这些和其它目的以如所附权利要求书中要求保护的和如本文一般性公开的本专利技术的不同方面的方式得到满足。如本文所用，术语“细胞外囊泡”是指包含包围内部空间的膜的细胞衍生的囊泡。细胞外囊泡包含所有膜结合的囊泡，其直径小于衍生其的细胞的直径。通常，细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm范围内，并且可以包含在内部空间内显示在细胞外囊泡的外表面上的和/或跨越膜的各种大分子负荷。所述负荷可以包含核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。作为实例而非限制，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操作(例如，通过连续挤出或用碱性溶液处理)衍生自细胞的囊泡、囊泡化细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可以衍生自活的或死的生物体、外植的组织或器官和/或培养的细胞。如本文所用，术语“纳米囊泡”是指包含包围内部空间的膜的细胞衍生的小(直径在20-250nm，更优选地直径在30-150nm之间)囊泡，并且所述小囊泡通过直接或间接操作由所述细胞生成，使得在没有所述操作的情况下，所述纳米囊泡不会由所述生产细胞产生。所述生产细胞的适当操作包括但不限于连续挤出、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在某些情况下，纳米囊泡的产生可以导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡群基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式衍生自生产细胞的囊泡。纳米囊泡包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载(例如治疗剂)、接收体(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其它分子。一旦根据所述操作纳米囊泡衍生自生产细胞，则所述纳米囊泡可以基于其尺寸、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。除非另有说明，否则术语“膜囊泡”或“治疗性膜囊泡”是指一种纳米囊泡。如本文所用，术语“外泌体”是指包含包围内部空间的膜的细胞衍生的小(直径在20-300nm，更优选地直径在40-200nm之间)囊泡，并且所述小囊泡通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合由所述细胞生成。通常，核外体的产生不会导致生产细胞的破坏。外泌体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载(例如治疗剂)、接收体(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其它分子。外泌体可以衍生自生产细胞，并且基于其尺寸、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。如本文所用，术语“细胞器”意指细胞内具有特异性功能的特定亚基。单个细胞器通常分别封闭在其自己的脂质双分子层即膜中。非限制性的示例性细胞器包括叶绿体、内质网、鞭毛、高尔基体(Golgiapparatus)、线粒体、内体、溶酶体、液泡和细胞核。如本文所用，术语“表位特异性结合物”意指结合到特异性表位的分子。表位是由免疫系统，具体地说是由抗体、B细胞或T细胞、噬菌体或适体识别的抗原的一部分。“表位特异性结合物”可以或不可以进一步结合到例如珠粒的表面上。表位特异性结合物的实例包括抗体、B细胞或T细胞或适体。如本文所用，术语“膜”意指生物膜，即允许某些化合物通过的细胞和细胞器的外覆盖物。在某些情形下，术语“膜”可以指脂质双分子层，其同时结合细胞外囊泡或细胞器并封闭囊泡内或细胞器内含物，并且随后将所述膜打开以暴露细胞外囊泡或细胞器的内含物并将所述内含物从开膜中离解。根据一个方面，提供产生膜囊泡的方法，所述方法包含：a.提供细胞外囊泡或细胞器；b.通过用pH为9至14的水性溶液处理来打开所述细胞外囊泡或所述细胞器以获得膜；c.去除囊泡内或细胞器内含物；和d.重新组装所述膜以形成膜囊泡。上述方法提供由已被打开的细胞外囊泡或细胞器产生的、从其囊泡内或细胞器内含物释放并且然后重新组装的膜囊泡。以这种方式产生的膜囊泡缺乏其可以天然含有的有害负荷，包括有害的内源性分子如DNA或核膜组分、或任何不希望的RNA种类、酶或其它蛋白质，以及感染性组分，如病毒、病毒组分，包括病毒基因组材料和或朊病毒蛋白或类似的感染性成分。从细胞外囊泡中去除任何天然存在的囊泡内含物降低了由此类囊泡内含物引起的可能副作用，并且因此降低不希望的效果的风险。类似地，从细胞器中去除任何天然存在的细胞器内含物降低了由此类细胞器内含物引起的可能副作用，并且因此降低不希望的效果的风险。通过去除任何天然存在的内含物，膜囊泡可以加载有治疗性化合物，并且从而用于诱导纯粹的治疗效果。虽然避免了囊泡内或细胞器内含物可以提供的任何潜在的负面副作用，但是保持了表面分子的作用。以此方式去除任何内含物优选地将不会影响膜结合的/表面结合的分子的功能。优选地维持所述膜结合/表面结合分子，因此优选地维持其功能。此类膜/表面分子的功能可以是靶向功能或治疗功能。如本文所公开的治疗性膜囊泡可能通过例如优化膜囊泡的产量(与细胞外囊泡相比)来解决当前细胞外囊泡治疗的多个问题。根据本方面的一个实施例，所述方法限于细胞外囊泡。根据本方面的一个实施例，所述方法限于细胞器。在一些实施例中，可以通过超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流和其组合中的一种或多种完成本文描述的方法的步骤d。因此，可以通过超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流或其组合完成重新组装打开的细胞外囊泡或细胞器的膜。可以采用这些技术中的一种或多种。在一些实施例中，本文描述的方法的步骤d可以通过超声处理来完成。通常，打开的细胞外囊泡或细胞器的膜的重新组装通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生膜囊泡的方法，其包含：a.提供细胞外囊泡或细胞器；b.通过用pH在9至14范围内的水性溶液处理来打开所述细胞外囊泡或所述细胞器以获得膜；c.去除囊泡内或细胞器内含物；和d.重新组装所述膜以形成膜囊泡。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.15 US 62/308,8051.一种产生膜囊泡的方法，其包含：a.提供细胞外囊泡或细胞器；b.通过用pH在9至14范围内的水性溶液处理来打开所述细胞外囊泡或所述细胞器以获得膜；c.去除囊泡内或细胞器内含物；和d.重新组装所述膜以形成膜囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d是通过超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、电流和其组合中的一种或多种来完成。3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包含：e.将负荷加载到所述膜囊泡中，其中步骤e可以伴随步骤d或在步骤d之后来进行。4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤e是在步骤d之后通过物理操作来完成，其中所述物理操作选自电穿孔、超声处理、机械振动、通过多孔膜挤出、施加电流和其组合。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述负荷选自合成生物活性化合物、天然生物活性化合物、抗菌化合物、抗病毒化合物、蛋白质、核苷酸、基因组编辑系统、微小RNA、siRNA、长链非编码RNA、反义寡核苷酸、吗啉基、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模拟物、DNA和其组合。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述负荷是TGF-β。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述基因组编辑系统是CRISPR系统。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述CRISPR系统是CRISPR-Cas9系统。9.根据权利要求5所述的方法，其中所述微小RNA或所述siRNA特异性地结合到编码突变型或非突变型致癌基因的转录物中。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述致癌基因是KRASG12D、KRASG12C、KRASG12V、N-Myc、c-Myc或L-Myc。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述膜囊泡具有至少一种不同于衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器群的生理特性，其中所述生理特性与以下各项中的一种或多种相关：生物分布、细胞摄取、半衰期、药效动力学、效力、剂量、免疫应答、加载效率、稳定性或对其它化合物的反应性。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述不同的生理特性是改善的靶向效率，改善的递送，或对受体细胞、器官或受试者的治疗性负荷的增加。13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中相比于将所述负荷加载到衍生所述膜囊泡的细胞外囊泡或细胞器中，所述负荷更有效地加载到所述膜囊泡中。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞外囊泡是衍生自细胞外囊泡体的细胞外囊泡亚群，或其中所述细胞器是衍生自多个细胞器的一种细胞器亚型。15.根据权利要求14所述的方法，其在步骤a之前进一步包含：使表位特异性结合物与所述细胞外囊泡体或所述细胞器接触；并且从所述细胞外囊泡体或多个细胞器中分离所述细胞外囊泡亚群或亚细胞器亚型。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述表位特异性结合物是抗体、噬菌体或适体。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述表位特异性结合物是针对至少一种线粒体膜蛋白、优选地MTCO2蛋白的抗体。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述表位特异性结合物是针对表面标记物CD63的抗体。19.一种治疗性膜囊泡，其包含：由膜形成的囊泡，所述膜衍生自细胞外囊泡或细胞器。20.根据权利要求19所述的治疗性膜囊泡，其中所述膜囊泡加载有治疗性负荷。21.根据权利要求20所述的治疗性膜囊泡，其中所述治疗性负荷包含选自以下各项的一种或多种治疗性化合物：合成生物活性化合物、天然生物活性化合物、抗菌化合物、抗病毒化合物、蛋白质、核苷酸、基因组编辑系统、微小RNA、siRNA、长链非编码RNA、反义寡核苷酸、吗啉基、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模拟物、DNA和其组合。22.根据权利要求20或21所述的治疗性膜囊泡，其中所述治疗性负荷包含催化ATP产生的酶。23...

【专利技术属性】
技术研发人员：扬·洛特瓦尔，张寿哲，
申请(专利权)人：科迪艾克生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US