共刺激结构域中具有重复结合基序的CAR制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变区片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序的共刺激结构域，和(iv)激活结构域。优选的共刺激结构域是衍生自人的CD28、4‑1BB、ICOS‑1、CD27、OX‑40、GITR或DAP10。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】共刺激结构域中具有重复结合基序的CAR序列表、表格或计算机程序的引用序列表通过EFS-Web，以ASCII格式的文本文件与说明书同时提交，文件名为“序列表.txt”，创建日期为2017年3月24日，大小为39.5千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，在此通过引用将其全部内容并入本文。专利
本专利技术涉及一种共刺激结构域中包含突变的嵌合抗原受体。本专利技术具体涉及一种共刺激结构域中具有重复活化基序的嵌合抗原受体T细胞。
技术介绍
免疫治疗逐渐成为一种非常有前途的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的武装力量，能够持续性地寻找外来抗原、辨别正常细胞和非正常细胞(癌症或感染细胞)。用CAR对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，代表了一种有效的免疫疗法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的T细胞可以增殖并在患者体内持续存在，像活的药物一样起效。CAR(嵌合抗原受体)通常包括一个单克隆抗体衍生的单链可变区片段(scFv)，通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号结构域和单个胞内激活CD3-ζ结构域。图1显示了CAR从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)到第三代CAR(具有多个共刺激结构域)的演变，参见Golubovskaya,Wu,癌症,2016Mar15；8(3)。生成的具有多个共刺激结构域的CAR(第三代CAR)会产生增加的细胞溶解活性，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。附图简要说明图1显示了从第一代到第三代的CAR的结构。图2显示了包含无突变和有突变的CD28共刺激结构域的间皮素CAR和EGFRCAR的结构。图3显示了具有突变型CD28结构域的间皮素CAR-T细胞对间皮素阳性卵巢癌细胞有高细胞溶解性。图4显示了具有突变型CD28结构域的间皮素CAR-T细胞对间皮素阴性癌细胞(C30细胞)无细胞溶解性。图5显示具有突变型CD28结构域的间皮素CAR-T细胞对间皮素阳性胰腺癌细胞有高细胞溶解性。图6显示了具有突变型CD28结构域的EGFRCAR-T细胞对EGFR阳性卵巢癌细胞有高细胞溶解性。图7显示了仅靶细胞、T细胞、MockCAR-T细胞、Meso-TM28-28WT-ZCAR-T细胞、Meso-TM28-28DD-ZCAR-T细胞和Meso-Flag-TM28-28DD-ZCAR-T针对A1847细胞的IFN-γ的分泌。图8显示了仅靶细胞、T细胞、MockCAR-T细胞、Meso-TM28-28WT-ZCAR-T细胞、Meso-TM28-28DD-ZCAR-T细胞和Meso-Flag-TM28-28DD-ZCAR-T针对A1847细胞的IL-2的分泌。图9显示了仅靶细胞、T细胞、MockCAR-T细胞、Meso-TM28-28WT-ZCAR-T细胞、Meso-TM28-28DD-ZCAR-T细胞和Meso-Flag-TM28-28DD-ZCAR-T针对A1847细胞的IL-6的分泌。图10显示了T细胞、MockCAR-T细胞、EGFR-TM28-28WT-Z细胞、EGFR-TM28-28DDT195P-Z细胞针对BxPC3细胞的IFN-γ的分泌。图11显示了T细胞、MockCAR-T细胞、EGFR-TM28-28WT-Z细胞、EGFR-TM28-28DDT195P-Z细胞针对BxPC3细胞的IL-2的分泌。图12显示了T细胞、MockCAR-T细胞、EGFR-TM28-28WT-Z细胞、EGFR-TM28-28DDT195P-Z细胞针对BxPC3细胞的IL-6的分泌。具体实施方式定义如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，衍生自不同与胞外结构域所衍生多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合具体抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的充当传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。如本文所用，FLAG标签、FLAG八肽、或FLAG表位是指可以利用重组DNA技术添加到某一蛋白中的多肽蛋白标签，具有序列为DYKDDDD(SEQIDNO:1)的基序。其可以融合到蛋白的C端或N端，或插入蛋白内。如本文所用，“单链可变区片段(scFv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。说明本专利技术人发现，通过在嵌合抗原受体(CAR)的共刺激结构域的结合基序中引入一个或多个特定突变，可以增加CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性。因此，该特定突变可增加CAR-T细胞的功能活性，使其更有效地攻击肿瘤细胞。本专利技术人还发现，与相应的野生型CAR-T细胞相比，具有这种突变CAR的CAR-T细胞通常产生较少的干扰素(IFN)-γ，并且可产生较少的白介素-2(IL-2)和较少的白介素-6(IL-6)，表明突变的CAR-T细胞比相应的野生型CAR-T细胞毒性更小，更安全。本专利技术涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变区片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序的共刺激结构域，和(iv)激活结构域。在一种实施方式中，所述的肿瘤抗原选自下组：间皮素、BCMA、VEGFR-2、CD4、CD5、CD19、CD20、CD30、CD22、CD24、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD47、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD138、CD171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3；PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2,10a、IGF1R、GD2、O-acetylGD2、O-acetylGD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gpl30、LewisA、LewisY、NGFR、MCAM、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、ROR-2、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、a、Frizzled、OX40、CD79b、和Notch-1-4。在一种实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.嵌合抗原受体融合蛋白，所述的融合蛋白从N‑末端到C‑末端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变片段(scFv)(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序的共刺激结构域，和(iv)激活结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.04 US 62/317,9751.嵌合抗原受体融合蛋白，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：(i)具有抗肿瘤抗原活性的单链可变片段(scFv)(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个具有一个或多个连续重复至少一次的结合基序的共刺激结构域，和(iv)激活结构域。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述的肿瘤抗原选自下组：间皮素、BCMA、VEGFR-2、CD4、CD5、CD19、CD20、CD30、CD22、CD24、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD47、CD52、CD56、CD80、CD81、CD86、CD123、CD138、CD171、CD276、B7H4、CD133、EGFR、GPC3；PMSA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、Eph10A、IGF1R、GD2、O-acetylGD2、O-acetylGD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gpl30、LewisA、LewisY、NGFR、MCAM、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、ROR-2、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、TCRa、TCRp、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、a、Frizzled、OX40、CD79b、和Notch-1-4。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述的肿瘤抗原是间皮素或EGFR。4.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，V·戈卢鲍夫斯卡亚，周华，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31