一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供了一种检测骨钙素的试剂盒，其检测灵敏度高、可靠性好。一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和底物溶液；校准品包括浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液；生物素标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL；辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法
本专利技术属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，具体涉及一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法。
技术介绍
骨质疏松症是一种静态疾病：发生骨折前的一些非特异性症状常常被忽视:如腰背痛。大多数病例是在骨折后被诊断的，相关的并发症大多为骨折，这一点极大地提高了医疗费用。早期诊断能够帮助减少医疗经费。越来越多的医院科室开设了骨质疏松检测，例如：内分泌科、骨科、妇产科、中医科等，并逐渐开始重视收治骨质疏松病人。目前我国的各级医院主要以骨密度作为辅助诊断标准，尚未全面使用骨代谢标志物指标。骨代谢标志物之一的骨钙素是在骨中含量十分丰富的非胶原蛋白，其总量占骨组织中非胶原蛋白的15%~20%。骨钙素由成骨细胞合成和分泌，与羟磷灰石有较强的亲和力，约50%沉着于骨基质，其余50%进入血循环。骨钙素的主要生理功能是维持骨的正常矿化速率，抑制异常的羟基磷灰石结晶的形成，抑制软骨矿化速率。通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态。骨钙素值随年龄的变化以及骨更新率的变化而不同。骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低。在原发性骨质疏松中，绝经后骨质疏松症是高转换型的，所以骨钙素明显升高；老年性骨质疏松症是低转换型的，因而骨钙素升高不明显。故可根据骨钙素的变化情况鉴别骨质疏松是高转换型的还是低转换型的，对临床研究骨疾病和内分泌代谢性骨病的发病机理﹑研究骨质成分具有重要意义。在国内，骨钙素检测临床上主要以国外罗氏公司试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。因此，有待开发一种骨钙素检测灵敏度高与可靠性好的试剂盒，以降低患者使用成本，并提高推广使用。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种检测骨钙素的试剂盒，其检测灵敏度高、可靠性好；此外，本专利技术还提供了适用该试剂盒检测骨钙素的方法。一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和底物溶液；所述校准品包括浓度为0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液；所述质控品包括浓度为25ng/mL、75ng/mL的骨钙素抗原溶液；所述生物素标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL；所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；所述底物溶液包括溶液A和溶液B，溶液A为含有0.4%鲁米诺，pH9.0的水溶液，溶液B为含有0.06%Na2B4O7，pH5.0的水溶液。进一步的，所述校准品、质控品均由骨钙素抗原与0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液配制得到，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761。进一步的，所述生物素标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为1.02mg/ml骨钙素抗体按1:20体积比加入到浓度为10mg/ml的生物素溶液中，然后将其加入到0.01MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃透析18小时以上，期间换液3-4次，第一次换液间隔2小时以上，其后间隔4小时，透析完成之后再用0.01M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液透析后调整浓度至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-2H9。进一步的，所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为0.98mg/ml的骨钙素抗体按1:20体积比加入到5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，混合后并纯化，得到辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体，所述纯化是用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡并洗脱，再紫外检测和记录纯化图谱，再用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液对辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体稀释至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-6F9。进一步的，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为：先将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀；然后在去除磁场的情况下，沉淀用0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液重悬，混匀磁分离；其次，加上磁场，使得链霉亲和素标记的纳米磁微粒沉出；再次，清洗沉淀；最后，清洗后链霉亲和素标记的纳米磁微粒分散于0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒购自GE公司，货号21152104010350。进一步的，所述试剂盒还包括洗液，所述洗液为含有1%吐温、0.1%Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH7.8。使用上述试剂盒检测骨钙素的方法，包括以下步骤：（1）将60μL链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、50μL生物素标记的骨钙素抗体和40μL待检血清样本混匀并反应，反应后置于磁场中静置并去上清，得到第一溶液；（2）向所述第一溶液中加入60μL辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体混匀并反应，反应后置于磁场中静置并去上清，得到第二溶液；（3）向所述第二溶液中加入200μL发光底物并反应，测发光强度；（4）利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤（3）得到的发光强度对照所述标准曲线，计算得出待测血清样本中骨钙素的含量。进一步的，步骤（1）中所述反应的条件为37℃下反应15分钟，所述静置的时间为2分钟；步骤（1）中还包括对所述第一溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；步骤（2）中所述反应的条件为37℃下反应15分钟，所述静置的时间为2分钟，步骤（2）中还包括对所述第二溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；步骤（3）中所述反应的条件为37℃下反应5分钟，在化学发光分析/测定仪中测定发光强度。进一步的，所述步骤（1）、步骤（2）中磁场的强度为10000高斯(G)。本专利技术的检测骨钙素的试剂盒检测灵敏度高、特异性能好、变异小，各试剂组分稳定性良好，有效期可至一年以上；该试剂盒在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达90%以上，且费用仅为其1/2，能够降低患者使用成本，提高其推广使用。附图说明图1为本专利技术的实施例一的检测骨钙素的试剂盒的标准曲线图。图2是本专利技术的骨钙素检测试剂盒与进口试剂的血清样本检测值相关性能拟合曲线。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲、素标记的纳米磁微粒悬浮液、底物溶液和洗液；所述校准品包括浓度为0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761；校准品由骨钙素抗原与0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液配制得到；所述质控品包括浓度为25ng/mL、75ng/mL的骨钙素抗原溶液，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761；质控品由骨钙素抗原与0.1M、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和底物溶液；所述校准品包括浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液；所述质控品包括浓度为25 ng/mL、75 ng/mL的骨钙素抗原溶液；所述生物素标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL；所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；所述底物溶液包括溶液A和溶液B，溶液A为含有0.4%鲁米诺，pH9.0的水溶液，溶液B为含有0.06%Na2B4O7 ，pH5.0的水溶液。

【技术特征摘要】
1.一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和底物溶液；所述校准品包括浓度为0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液；所述质控品包括浓度为25ng/mL、75ng/mL的骨钙素抗原溶液；所述生物素标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL；所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；所述底物溶液包括溶液A和溶液B，溶液A为含有0.4%鲁米诺，pH9.0的水溶液，溶液B为含有0.06%Na2B4O7，pH5.0的水溶液。2.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述校准品、质控品均由骨钙素抗原与0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液配制得到，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761。3.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为1.02mg/ml骨钙素抗体按1:20体积比加入到浓度为10mg/ml的生物素溶液中，然后将其加入到0.01MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃透析18小时以上，期间换液3-4次，第一次换液间隔2小时以上，其后间隔4小时，透析完成之后再用0.01M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液透析后调整浓度至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-2H9。4.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为0.98mg/ml的骨钙素抗体按1:20体积比加入到5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，混合后并纯化，得到辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体，所述纯化是用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡并洗脱，再紫外检测和记录纯化图谱，再用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液对辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体稀释至1μg/mL；骨钙素抗体购自...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩霜，白仲虎，张俊兰，
申请(专利权)人：江南大学，江苏拜明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32