一种天麻伴生蜜环菌栽培种快繁方法技术

本发明专利技术公开了一种天麻伴生蜜环菌栽培种的快繁方法，实现38天结束母种—栽培种的全过程；过程中液‑液菌种结合，分三个阶段制备蜜环菌栽培种；蜜环菌栽培种能从水浸渍状态转化为膏状、污染率低至2%，栽培种常温避光保存可达1年。该技术的培养基成分简单、易标准化，同时操作过程简单且菌种培养时间短，解决了天麻伴生蜜环菌栽培种的制种慢与污染率高的技术难题，具有很大的应用和推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种天麻伴生蜜环菌栽培种快繁方法
本专利技术涉及农业科技种子生产
，尤其是一种天麻伴生蜜环菌栽培种快繁方法。
技术介绍
蜜环菌系伞菌目、膨瑚菌科、蜜环菌属的兼性寄生性真菌，广泛分布于世界各地。它是一类具有重要经济价值的高等真菌，不仅具有清目、利肺、益肠胃、抗痉挛、镇静、扩张血管、降血压等药理作用，且子实体、菌丝、菌索都可以入药。此外，名贵中药猪苓和天麻必须依靠蜜环菌提供营养才能生长繁殖。目前全球通过互交不育性实验鉴定的蜜环菌生物种多达40种，我国鉴定的蜜环菌生物种约有15种，主要分布在东北、华中、西南地区，为Armillaria.gallica、Armillaria.ostayae、Armillaria.tabescens、Armillaria.mellea、Armillaria.sinpina、Armillaria.borealis、Armillaria.gallica、CBCC、CBCF、CBCG、CBCH、CBCJ、CBCN、CBCO、CBCP。不同的蜜环菌生物种，甚至是不同的菌株间对天麻的促生作用是有很大区别的。自兰进（2000）公开发表论文阐述蜜环菌A9具有较好的天麻促生作用后，市场上普遍应用栽培天麻的蜜环菌菌株多为A9，少有其它优良菌株出现如京234、GZA46等，且蜜环菌栽培种市场混乱，多为相互引种，没有自己的菌种知识产权。同时天麻伴生蜜环菌栽培种制作技术相对于其他食用菌较为落后，菌种厂多采用母种、原种、栽培种的固体菌种转接生产方式，活力好的菌株从母种到栽培种长满袋至少要4个月，且污染率较高达10%。以天麻产区贵州为例，省内仅两大天麻主产区大方县、德江县每年的蜜环菌需求量约在400万瓶以上，且优良菌种供不应求，而省内被认可的蜜环菌厂家仅有2家。建立优良天麻伴生蜜环菌的高效、快繁方法，减少栽培种污染率，节约菌种生产成本，从源头上降低麻农投入是天麻产业稳步发展的根本。本专利专利技术的天麻伴生蜜环菌快繁技术，分三个阶段制备蜜环菌栽培种、38天即可完成整个过程；采用蜜环菌液体菌种制备栽培种，同时水封栽培种培养基，使栽培种污染率降低至2%；同时生产的蜜环菌栽培种常温避光保存可达1年。该技术使天麻伴生蜜环菌的工厂化生产与应用真正成为可能，解决了天麻伴生蜜环菌栽培种的制种慢与污染率高的技术难题，具有很大的应用和推广价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种天麻伴生蜜环菌栽培种的快繁方法，实现38天结束母种—栽培种的全过程；过程中液-液菌种结合，分三个阶段制备蜜环菌栽培种；蜜环菌栽培种能从水浸渍状态转化为膏状、污染率低至2%，栽培种常温避光保存可达1年。本专利技术是这样实现的，包含以下步骤：1）液体培养基制作：按葡萄糖40g/L、无水乙醇28g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨12g/L、硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾1g/L、VB10.01g/L、VB20.03g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min），冷却后取出备用。2）蜜环菌一级液体菌种制备：将天麻伴生蜜环菌母种置于超净工作台中，无菌条件下切取0.5cm长的菌索尖端5段转接入蜜环菌液体培养中。封口后180r/min、22℃暗培养12天即为蜜环菌一级液体菌种。3）蜜环菌一级液体菌种的无菌匀质：无菌条件下，取蜜环菌一级液体菌种一瓶于无菌匀质袋中；用无菌匀质器破碎蜜环菌菌丝球，参数为每秒10次拍击，匀浆9分钟。无菌匀质完后，破碎菌丝全部分装至无菌三角瓶中（体积250ml）。4）蜜环菌二级液体菌种制备：超净工作台中，吸取5mL破碎的蜜环菌菌丝转接入液体培养基中。封口后180r/min、22℃暗培养4天即为蜜环菌二级液体菌种。5）枝条栽培种培养基制作：将直径1-2㎝带皮的青冈树枝斜切成长1.5㎝的枝条后晒干；分装枝条于750ml聚丙烯菌种瓶中（瓶高18.7cm、底部直径8.5㎝、瓶口直径4.1㎝），加自来水封口至菌瓶口下端1.5㎝处，同时加入玉米粉（10g/瓶）、黄豆粉（5g/瓶）、白糖（3g/瓶）；最后121℃、灭菌3.5h，冷却后取出备用。6）蜜环菌栽培种制备：将蜜环菌二级液体菌种、枝条栽培种用75%酒精擦拭后，置于接种箱中；密闭接种箱、烟雾消毒剂熏蒸0.5h后，于酒精灯火焰旁将蜜环菌液体种倒入枝条栽培种（接种量为15ml）。封瓶完成转接后22℃暗培养，22天蜜环菌菌索即可长满瓶。附图说明图1蜜环菌液体菌种；图2蜜环菌栽培种。具体实施例。2017年1-2月，在贵州省农业科学院农作物品种资源研究所（现代中药材研究所）真菌室进行天麻伴生蜜环菌栽培种的培养，具体步骤如下：1）2017年1月2日进行蜜环菌液体培养基制作：按葡萄糖40g/L、无水乙醇28g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨12g/L、硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾1g/L、VB10.01g/L、VB20.03g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min），冷却后取出备用。2）2017年1月4日进行蜜环菌一级液体菌种制备：将天麻伴生蜜环菌母种置于超净工作台中，无菌条件下切取0.5cm长的菌索尖端5段转接入蜜环菌液体培养中。封口后180r/min、22℃暗培养12天即为蜜环菌一级液体菌种，于1月27日完成摇瓶培养。3）2017年1月28日进行蜜环菌一级液体菌种的无菌匀质：无菌条件下，取蜜环菌一级液体菌种一瓶于无菌匀质袋中；用无菌匀质器破碎蜜环菌菌丝球，参数为每秒10次拍击，匀浆9分钟。无菌匀质完后，破碎菌丝全部分装至无菌三角瓶中（体积250ml）。4）2017年1月底进行蜜环菌二级液体菌种制备：超净工作台中，吸取5mL破碎的蜜环菌菌丝转接入液体培养基中。封口后180r/min、22℃暗培养4天即为蜜环菌二级液体菌种，于2月3日结束液体摇瓶。5）2017年2月2日进行枝条栽培种培养基制作：将直径1-2㎝带皮的青冈树枝斜切成长1.5㎝的枝条后晒干；分装枝条于750ml聚丙烯菌种瓶中（瓶高18.7cm、底部直径8.5㎝、瓶口直径4.1㎝），加自来水封口至菌瓶口下端1.5㎝处，同时加入玉米粉（10g/瓶）、黄豆粉（5g/瓶）、白糖（3g/瓶）；最后121℃、灭菌3.5h，冷却后取出备用。6）2017年2月4日进行蜜环菌栽培种制备：将蜜环菌二级液体菌种、枝条栽培种用75%酒精擦拭后，置于接种箱中；密闭接种箱、烟雾消毒剂熏蒸0.5h后，于酒精灯火焰旁将蜜环菌液体种倒入枝条栽培种（接种量为15ml）。封瓶完成转接后22℃暗培养，22天蜜环菌菌索即可长满瓶，于2月27日菌索长满瓶，同时转至室温下避光保存。7）2018年2月底进行蜜环菌栽培种的活力验证，即将常温避光保存一年的蜜环菌栽培种置于超净工作台中，于无菌条件转接至PDA平板中暗培养（22℃），观察接种点萌动和菌索生长情况。结果表明，转接至PDA平板中的栽培种3天后萌动形成白色/褐色的菌丝，5天后长出新生菌索，其后菌索生长速度为1.3cm/d。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种天麻伴生蜜环菌栽培种快繁方法，其特征在于：液‑液菌种结合，分三个阶段制备蜜环菌栽培种、38天完成整个过程；蜜环菌栽培种能从水浸渍状态转化为膏状、污染率低至2%，栽培种常温避光保存可达1年。

【技术特征摘要】
1.一种天麻伴生蜜环菌栽培种快繁方法，其特征在于：液-液菌种结合，分三个阶段制备蜜环菌栽培种、38天完成整个过程；蜜环菌栽培种能从水浸渍状态转化为膏状、污染率低至2%，栽培种常温避光保存可达1年。2.根据权利要求1所述的液-液菌种结合具体是指，通过二次蜜环菌液体传代培养后，转接蜜环菌液体菌种到水浸渍的枝条栽培种培养基中培养蜜环菌。3.根据权利要求1所述分三个阶段制备蜜环菌栽培种是指，先制备蜜环菌一级液体菌种（12天），再制备蜜环菌二级液体菌种（4天），最后制备蜜环菌栽培种（22天）。4.一、二级液体菌种培养基成分一致，培养参数均为22℃暗培养、150r/min、二级液体菌接种量1:30（体积比）。5.根据权利要求2所述的二次蜜环菌液体传...

【专利技术属性】
技术研发人员：桂阳，黄万兵，朱国胜，张丽娜，杨通静，龚光禄，卢颖颖，陈娅娅，郎柳录，
申请(专利权)人：贵州省农作物品种资源研究所，贵州利康农科技有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52