一种永生化类淋巴母细胞系建立的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种永生化类淋巴母细胞系(Lymphoblastoid cell lines,LCLs)的建立方法，利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞，建立所述LCLs。所述方法通过加入抗IL‑2受体α链(CD25)单克隆抗体，抑制T淋巴细胞的活化和增殖，从而提高EB病毒对外周血B淋巴细胞的转化率。本发明专利技术还公开了用于EB病毒转化外周血B淋巴细胞为永生化类淋巴母细胞系LCLs的试剂盒，所述试剂盒适用于EB病毒转化人类外周血B淋巴细胞为LCLs，操作简单，转化效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种永生化类淋巴母细胞系建立的方法和试剂盒
本专利技术涉及一种永生化类淋巴母细胞系建立的方法和试剂盒，具体涉及由EB病毒转化外周血B淋巴细胞建立永生化类淋巴母细胞系的方法和试剂盒，属于生物医学

技术介绍
EB病毒是爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)的简称，是一种疱疹样病毒。EB病毒转化外周血B淋巴细胞，可使其成为一种能连续分裂，无限增殖的类淋巴母细胞系(Blymphoblastoidcelllines,LCLs)。通过此方法建立的LCLs是一种永生化细胞株，可以永远传代；这种永生化细胞株还可保存原来提供血样个体的完整基因组,且保持其生化和分子生物学特性不发生变化。因此，利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞，是目前建立遗传资源标本库的首选方法，它可为出生缺陷及其它罕见疾病的遗传流行病学、临床遗传学、分子生物学等研究提供永久性试验材料。EB病毒可通过结合B淋巴细胞表面上的EB病毒受体感染B淋巴细胞，通过一系列过程导致B淋巴细胞的永生化。通常情况下，只有B淋巴细胞能受到感染，但少数情况下，T淋巴细胞也可被感染。这些被激活的记忆性T细胞可对EB病毒感染、转化的自体B淋巴细胞产生特异的细胞毒作用，进而攻击已经被EB病毒感染、转化的B淋巴细胞。此外，CD4+T细胞也可通过CD95与CD95配体结合，介导永生化B细胞的凋亡，进而导致转化的B淋巴细胞退化。因此，设法抑制、减少或去除T淋巴细胞，就成为建立EB病毒转化外周血B淋巴细胞生成LCLs的关键。1986年，德国学者Neitzel首次利用免疫抑制剂环胞菌素A(CyclosporinA)，通过特异性抑制T淋巴细胞中的RNA聚合酶II，由外周血B淋巴细胞中建立LCLs。该方法极大的增加了EB病毒对外周血B淋巴细胞的转化率。然而，环胞菌素A毒性较大，可诱导细胞的凋亡和坏死，从而降低B淋巴细胞的转化效率。目前，关于EB病毒转化外周血B淋巴细胞的方法学上尚没有一个公认的统一的标准,导致各个实验室所使用的方法不尽相同；此外，国内市场上也没有用于EB病毒转化外周血B淋巴细胞的成品试剂盒。因此，有必要提供一种EB病毒转化外周血B淋巴细胞的方法和试剂盒以克服上述缺陷。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺陷，提供了一种新的利用抗IL-2受体α链单克隆抗体(Anti-IL-2RAantibody)协同EB病毒转化外周血B淋巴细胞的方法和试剂盒。本专利技术的方法和试剂盒可用于EB病毒转化外周血B淋巴细胞成为永生化的LCLs，该方法和试剂盒转化的成功率在90％以上。本专利技术提出了一种抗IL-2受体α链单克隆抗体在用于由EB病毒转化转化B淋巴细胞，建立永生化类淋巴母细胞系(LCLs)中的应用。本专利技术中，所述抗IL-2受体α链(CD25)单克隆抗体可以为任何抗CD25的单克隆抗体，包括但不限于，是ThermoFisherScientific公司生产的货号为36-0251-85、产品名称为CD25MonoclonalAntibody(PC61.5)，Biotin，FunctionalGrade，eBioscienceTM的单克隆抗体。本专利技术还提出了如上所述的抗IL-2受体α链单克隆抗体在制备由EB病毒转化B淋巴细胞，建立永生化类淋巴母细胞系(LCLs)的试剂盒中的应用。本专利技术还提出了一种试剂盒，其包括如上所述的抗IL-2受体α链单克隆抗体。进一步地，所述试剂盒包括：冻存的B-958细胞，0.45μm滤头，淋巴细胞分离液和抗IL-2受体α链单克隆抗体。本专利技术还提出了所述的试剂盒在用于由EB病毒转化B淋巴细胞，建立永生化类淋巴母细胞系(LCLs)中的应用。本专利技术还提出了一种建立永生化类淋巴母细胞系(LCLs)的方法，所述方法包括：将由B-958细胞产生的EB病毒与人外周血单个核细胞(PBMC)混合，并向其中加入根据权利要求1所述的抗IL-2受体α链单克隆抗体，抑制T淋巴细胞的活化和增殖，提高EB病毒转化B淋巴细胞为LCLs的效率。本专利技术所述方法中，抗IL-2受体α链单克隆抗体的母液浓度为1mg/ml。所述抗IL-2受体α链单克隆抗体的工作浓度为10-100ug/ml。优选地，所述抗IL-2受体α链单克隆抗体的工作浓度为20μg/ml。具体地，本专利技术建立永生化类淋巴母细胞系(LCLs)的方法，是通过以下技术方案实现的：1.EB病毒的制备：1)复苏B-958细胞：取出试剂盒中冻存的B-958细胞，迅速置于37℃水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化。融化后，从37℃水浴中取出冻存管，吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上1640完全培养基(含以下体积百分比的组分：10％胎牛血清、1％链霉素、1％青霉素和1％谷胺酰胺)，混匀后离心(1000rpm，5min)，弃去上清；2)向细胞中加入1640完全培养基，于5％CO2，37℃条件下培养,调整细胞状态至对数期；3)细胞计数，利用1640完全培养基，调整细胞浓度为1×106/ml；4)取10ml上述浓度为1×106/ml的B-958细胞，置于25ml的培养瓶中，于5％CO2，37℃条件下饥饿培养10天；5)于第11天吸出细胞及培养上清，600g，4℃，离心10分钟，取出上清；6)0.45μm滤头对上清进行过滤，测定病毒滴度；7)按照1ml/支对EB病毒进行分装，冻于-80℃进行保存。2.人外周血PBMC分离：1)取人外周静脉肝素抗凝血1ml，加入1mlPBS对半稀释；2)加淋巴细胞分离液1ml于15ml离心管中；3)利用毛细吸管将稀释好的血液沿管壁徐徐加入分离液试管中，使与分离液形成一界面，两者不能混合；4)室温条件下，2200rpm，升速5，降速0，离心23分钟；5)用毛细吸管小心吸取单个核细胞(PBMC)层，置于新的15ml离心管中，加入5倍以上PBS，1500rpm×10分钟，洗涤2次；6)细胞计数。利用1640完全培养基将细胞浓度调整至2×106/ml，进行计数；。3.EB病毒感染B淋巴细胞1)将上述获取的1mlEB病毒与1ml人外周血PBMC按照1:1的体积比例进行混合，加入至6孔板的一个孔中进行培养；2)加入终浓度为20μ/ml的抗IL-2受体α链单克隆抗体，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时；3)离心，去除上清，加入2ml1640完全培养基继续进行培养，同时加入终浓度为20μ/ml的抗IL-2受体α链单克隆抗体；4)每3天半量换液。每次换液时同时加入终浓度为20μ/ml的抗IL-2受体α链单克隆抗体。5)培养两周后，仍为每3天半量换液，但此后不再加入抗IL-2受体α链单克隆抗体，仅加入1640完全培养基。4.LCLs的形态学观察培养1个月后，成功建立LCLs。建系成功的LCLs有两个明显的特征,淋巴细胞体积增大,且聚集成团。细胞发生永生化，可无限传代。本专利技术还提出了一种永生化类淋巴母细胞系(LCLs)，所述LCLs由如上所述的EB病毒在抗IL-2受体α链单克隆抗体存在的情况下，通过转化B淋巴细胞建立而来。本专利技术还提出了根据如上所述方法制备得到的永生化类淋巴母细胞系(LCLs)。本专利技术中，所述B淋巴细胞优选为外周血B淋巴细胞。本专利技术的有益效果在于，本专利技术采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞，通过加入特定浓度的抗I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗IL‑2受体α链单克隆抗体在用于由EB病毒转化B淋巴细胞，建立永生化类淋巴母细胞系LCLs中的应用。

【技术特征摘要】
1.抗IL-2受体α链单克隆抗体在用于由EB病毒转化B淋巴细胞，建立永生化类淋巴母细胞系LCLs中的应用。2.抗IL-2受体α链单克隆抗体在制备由EB病毒转化B淋巴细胞，建立永生化类淋巴母细胞系LCLs的试剂盒中的应用。3.一种试剂盒在用于由EB病毒转化B淋巴细胞建立永生化类淋巴母细胞系LCLs中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗IL-2受体α链单克隆抗体。4.一种建立永生化类淋巴母细胞系LCLs的方法，其特征在于，所述方法包括：将由B-958细胞产生的EB病毒与外周血单个核细胞PBMC混合，并向其中加入抗IL-2受体α链单克隆抗体，抑制T淋巴细胞的活化和增殖，提高EB病毒转化B淋巴细胞为LCLs的效率。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗IL-2受体α链单克隆抗体的工作浓度为10-100ug/ml。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗IL-2受体α链单克隆抗体的工作浓度为20μg/ml。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：(A)EB病毒的制备：1)复苏B-958细胞：取出试剂盒中冻存的B-958细胞，迅速置于37℃水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化；融化后，从37℃水浴中取出冻存管，吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上1640完全培养基，混匀后1000rpm离心5min，弃去上清；其中，所述1640完全培养基含体积百分比为10％胎牛血清、1％链霉素、1％青霉素和1％谷胺酰胺；2)向细胞中加入1640完全培养基，于5％CO2，37℃条件下培养,调整细胞状态至对数期；3)细胞计数，利用1640完全培养基，调整细胞浓度为1×106/ml；4)取10ml上述浓度为1×106/ml的B-958细胞，置于25ml的培养瓶中，于5％CO2，37℃条件下饥饿培养10天；5)于第11天吸出细胞及培养上清，600g，4℃，离心10分钟，取出上清；6)0.45μm滤头对上清进行过滤，测定病毒滴度；7)按照1ml/支对EB病毒进行分装，冻于-80℃进行保存；(B)人外周血PBMC分离：1)取人外...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜飞，
申请(专利权)人：远见生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31