一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞分离技术领域，具体涉及一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法。该方法将抗原偶联的荧光素和感染抗原的外周血单核细胞悬液分别加入半固体培养基中，由于半固体培养基具有的特殊流动性使得目标B细胞分泌的抗体分布在B细胞的四周不发生游离，分布在目标B细胞周围的抗体与半固体培养基中的抗原偶联荧光素进行免疫发应，抗原偶联的荧光素在目标B细胞的周围发生聚集形成荧光亮点，通过观察半固体培养中荧光素的发光现象，挑选荧光亮点即为目标B细胞；目标B细胞分泌抗体的能力越强，会在其周围聚集越多的荧光素，观察到的荧光亮点的亮度就越大，通过观察荧光亮点的亮度分离和鉴别目标B细胞分泌抗体的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法
本专利技术涉及细胞分离
，具体涉及一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法。
技术介绍
分离、培养及鉴定产生特异性结合某目标抗原的抗体的B细胞的方法在本领域研究中非常重要的。这种B细胞可以用于制备抗原特异性抗体以及回收编码这种抗体的核酸序列，还可用于抗原结合特异性分析等功能测定。抗体由B细胞产生，可以用于鉴定外源性或内源性抗原，如毒素、细菌、病毒、细胞因子、酶等。每种抗体结合抗原的特定表位。抗体识别特异性表位且与之结合的能力使抗体成为有用的治疗和诊断工具。分离、培养及鉴定产生特异性结合某种目标抗原的抗体的B细胞的方法在免疫
非常重要。早期获得免疫系统中针对某种抗原的B细胞，并制备单可控抗体的方法是杂交瘤方法，但是抗原特异性B细胞在脾脏细胞中的“丰度”使分离抗原特异性克隆变得随机性很大，而且必须有一个骨髓瘤细胞。小鼠的骨髓瘤细胞容易获得，但是对于兔、骆驼等一些其他种属的动物很难或无法获得骨髓瘤细胞。因此杂交瘤方法在应用过程中存在很多局限。由此后续逐渐出现了利用流式细胞术分离B细胞的方法，但是这种方法需要昂贵的流式细胞仪，需要至少两到三种不同的标记试剂，成本高，操作复杂，复杂的操作又会对B细胞的质量和活性产生影响，为了克服这种缺陷，中国专利CN106350485A公开了一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，该方法主要是通过制备偶联配体的活化免疫磁珠，来对特异性分泌抗原抗体的B细胞进行分离，但是该方法中需要制备免疫磁珠，同时需要排除非分泌抗体的B细胞所造成的影响，并且无法目标B细胞分泌抗体的能力进行筛选。因此亟需一种操作简单、无需排除非分泌抗体的B细胞的影响即可直接筛选出目标B细胞，并且能够在一定程度上识别出目标B细胞分泌抗体的能力。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，操作简便，成本低，无需排除非分泌抗体的B细胞的影响即可直接筛选出目标B细胞，并且能够在一定程度上识别出目标B细胞分泌抗体的能力。为了实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，包括以下操作步骤：1）从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液；2）取半固体培养基，在半固体培养基中加入抗原偶联的荧光素，混合搅拌均匀；3）将步骤1）的外周血单核细胞悬液加入步骤2）处理后的半固体培养基中，混合搅拌均匀；4）在荧光显微镜下挑选步骤3）处理后的半固体培养基中的荧光亮点，即得抗原特异性B细胞。可选的，步骤3）中所述静置培养的时间为12~24小时。为了避免加入的外周血单核细胞悬液影响半固体培养基的流动性等性质，可选的，步骤3）中半固体培养基与外周血单核细胞悬液的体积比为100：1。可选的，步骤4）中采用毛细管吸取挑选步骤3）处理后的半固体培养基中的荧光亮点。也可以采用其他的挑选细胞用针挑选荧光亮点，放置在细胞含有细胞培养基的孔板中用于后续进一步研究实验使用。可选的，荧光素为能够与抗原蛋白上的氨基自动发生偶联的荧光素。比如异硫氰酸荧光素或藻红蛋白，或者其他具有一定化学反应活性能够与抗原蛋白上的氨基在一定条件下自动发生偶联即可。上述方法中步骤2）和步骤3）可以采用无菌玻璃棒或Tip头慢速搅拌均匀，注意避免带入气泡。可选的，步骤1）中从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液的具体方法为：利用密度梯度法进行离心分层，收集单核细胞层，经过PBS等洗涤，获取目标单核细胞。本专利技术高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，将抗原偶联的荧光素和感染抗原的外周血单核细胞悬液分别加入半固体培养基中，由于半固体培养基具有的特殊流动性使得目标B细胞分泌的抗体分布在B细胞的四周不发生游离，那么分布在目标B细胞周围的抗体与半固体培养基中的抗原偶联荧光素进行免疫发应，抗原偶联的荧光素在目标B细胞的周围发生聚集，由于抗原偶联的荧光素均匀分布在半固体培养基中，在荧光显微镜下观察时，均匀分布的抗原偶联的荧光素仅存在本底值荧光反应，周围发生抗原偶联荧光素聚集的细胞周围会产生荧光亮点，通过挑选该荧光亮点即可获得目标B细胞；而且由上述原理可知目标B细胞分泌抗体的能力越强，分泌的抗体越多，荧光亮点亮度越高，那么可以通过观察荧光亮点的亮度分离和鉴别目标B细胞分泌抗体的能力。本专利技术方法的关键是利用了半固体培养基的特殊流动性，使得目标B细胞分泌的抗体能够分布在其周围不发生游离，与半固体培养基的基质成分无关，只需要确保半固体培养基的基质本身与抗体不发生发应即可。本专利技术方法不依赖骨髓瘤细胞，操作简便、高效，可一步快速获得抗原特异性B细胞，无需排除非特异性B细胞的干扰，减少实验环节，整个试验过程中几乎不会对细胞产生任何伤害，降低了对后续实验所产生的影响。附图说明图1是本专利技术实施例提供的分离单个抗原特异性B细胞的方法的原理示意图；图2是本专利技术实施例荧光纤维镜观察到的半固体培养基的发光现象。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。下述实施例中从感染抗原的兔外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液的方法为本领域惯用的方式，例如利用密度梯度法进行离心分层，收集单核细胞层，经过PBS等洗涤，获取目标单核细胞。实施例一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，包括以下操作步骤：1）从感染抗原的兔外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液；2）取半固体培养基，在半固体培养基中加入抗原偶联的异硫氰酸，采用无菌玻璃棒慢速搅拌均匀，搅拌过程中避免出现气泡；3）按照1：100的体积比将步骤1）的外周血单核细胞悬液加入步骤2）处理后的半固体培养基中，采用无菌玻璃棒慢速搅拌均匀，搅拌过程中避免出现气泡，静置培养12~24小时；4）在荧光显微镜下采用毛细管吸取步骤3）处理后的半固体培养基中的荧光亮点，如图2所示，即得抗原特异性B细胞。如图1所示，本实施例提供的方法的原理是将抗原4偶联的荧光素1和感染抗原的外周血单核细胞悬液分别加入半固体培养基中，由于半固体培养基具有的特殊流动性使得目标B细胞2分泌的抗体3分布在B细胞2的四周不发生游离，那么分布在目标B细胞2周围的抗体3与半固体培养基中的抗原4偶联荧光素1进行免疫发应，抗原偶联的荧光素在目标B细胞的周围发生聚集，由于抗原偶联的荧光素均匀分布在半固体培养基中，在荧光显微镜下观察时，均匀分布的抗原偶联的荧光素仅存在本底值荧光反应，周围发生抗原偶联荧光素聚集的细胞周围会产生荧光亮点，通过挑选该荧光亮点即可获得目标B细胞；而且由上述原理可知目标B细胞分泌抗体的能力越强，分泌的抗体越多，荧光亮点亮度越高，那么可以通过观察荧光亮点的亮度分离和鉴别目标B细胞分泌抗体的能力。需要说明的是，上述实施例中外周血单核细胞悬液与半固体培养基的体积比仅仅用作举例说明，只需要确保加入的细胞悬液不影响半固体培养基的流动性等性质即可；荧光素的种类、荧光点的挑选方式和混合搅拌均匀的搅拌方式仅仅用作举例说明，并不构成对本专利技术的具体限定。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本专利技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本专利技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1）从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液；2）取半固体培养基，在半固体培养基中加入抗原偶联的荧光素，混合搅拌均匀；3）将步骤1）的外周血单核细胞悬液加入步骤2）处理后的半固体培养基中，混合搅拌均匀，静置培养；4）在荧光显微镜下挑选步骤3）处理后的半固体培养基中的荧光亮点，即得抗原特异性B细胞。

【技术特征摘要】
1.一种高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1）从感染抗原的人或动物的外周血全血分离获得外周血单核细胞悬液；2）取半固体培养基，在半固体培养基中加入抗原偶联的荧光素，混合搅拌均匀；3）将步骤1）的外周血单核细胞悬液加入步骤2）处理后的半固体培养基中，混合搅拌均匀，静置培养；4）在荧光显微镜下挑选步骤3）处理后的半固体培养基中的荧光亮点，即得抗原特异性B细胞。2.如权利要求1所述的高效分离单个抗原特异性B细胞的方法，其特征在于，步骤3）中所述静置培养的时间为12~24小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟晋豫，刘玲玲，徐星星，常秋霜，齐华，刘文弟，
申请(专利权)人：河南赛诺特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41