一株产尿素细菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株产尿素细菌及其应用，属于微生物肥料技术领域。所用的产尿素细菌为辣椒芽孢杆菌(Bacillus zanthoxyli)1433菌株，该菌株已于2018年6月14日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号：CCTCC No:M 2018369。本发明专利技术的辣椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株在微生物常规培养条件下能产生尿素，其菌体和代谢产物应用于制备微生物肥料中。本发明专利技术的有益效果在于：利用1433菌株制备的微生物肥料替代尿素时，对烤烟、番茄的增产率仍在20％以上，具有使用成本低、增产效果好、无残留、对人畜和环境安全的特点。

【技术实现步骤摘要】
一株产尿素细菌及其应用
本专利技术涉及一株产尿素细菌及其应用，属微生物肥料

技术介绍
氮是植物正常生长发育过程中所必需的重要元素，氮肥对粮食增产的贡献率达40％，是农业生产中限制作物产量的主导因素(Jonesetal.,2005)。我国绝大部分耕地土壤氮素供应不足，需要不断增施氮肥以保证作物的持续高产(刘春红等，2003)。尿素是目前国际上农业生产中应用最广泛、施用量最大的氮肥品种，约占50％的世界氮肥生产及消费市场。然而，长期过量施用氮肥导致土壤结构恶化、氮肥利用率低，还会出现过量的氮肥以氨挥发、反硝化、淋洗等途径大量流失，既造成巨大的经济损失，又给生态环境和人类健康带来严重的危害(Nosengo，2003)。2015年农业部提出了“一控两减三基本”目标，其中包括到2020年化肥用量要实现零增长；因此，研发和推广新型生物氮肥显得极为重要。生物源尿素主要来自哺乳动物、两栖动物以及水生浮游生物、鱼类、异养细菌等(Solomonetal,2010)，海洋沉积物中的尿素主要是细菌产生的(Pedersenetal.,1993)。Escherichiacoli、Fragilartacrotonensis、Micrococcusdenitrificans、Sporosarcinaureae等细菌可产生尿素(Perozichetal.,1998)。辣椒芽孢杆菌(Bacilluszanthoxyli)1433菌株是本专利技术人等报道的一细菌新物种(Maetal.,2017)。本专利技术人在近期的研究中首次发现1433菌株在常规培养基上能产生尿素,对番茄、烤烟等作物具有显著的促进生长的作用，是研发生物肥料的重要菌株，而该细菌的产尿素特性及其在微生物肥料上的应用未见报道。主要参考文献:JonesDL,HealeyJR,WilettVB，et.al.Dissolvedorganicnitrogenuptakebyplants:AnimportantNuptakepathway.SoilBiologyandBiochemistry.2005,37:413-423.NosengoN.Fertilizedtodeath.Nature,2003，425:894-895.PedersenH,LomsteinBA,BlackburnTH.1993.Evidenceforbacterialureaproductioninmarinesediments.FEMSMicrobiologyEcology,12:51-59.PerozichJ,HempelJ,MorrisJSM.1998.Rolesofconservedresiduesinthearginasefamily.BiochimicaetBiophysicaActa,1382:23-37.SolomonCM,CollierJL,BergGMetal.2010.Roleofureainmicrobialmetabolisminaquaticsystems:abiochemicalandmolecularreview.AquaticMicrobialEcology,59:67-88.MaL,CaoYH,MoMH,etal.2017.Bacilluszanthoxylisp.nov.,anovelnematicidalbacteriumisolatedfromChineseredpepper(ZanthoxylumbungeanumMaxim)leavesinChina，AntonievanLeeuwenhoek，110:1179-1187.
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种产尿素细菌及其应用。本专利技术具体是这样实现的：本专利技术人采用细菌传统分离方法，从采自甘肃省陇南市的辣椒叶片上获得了一株细菌1433菌株，鉴定为辣椒芽孢杆菌(Bacilluszanthoxyli)(Maetal.,2017)。辣椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株已于2018年6月14日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号：CCTCCNo:M2018369。辣椒芽孢杆菌1433菌株为革兰氏阳性菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径2-5mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6-0.9μm，长1.2-1.5μm，细胞具游动性。该菌株在4-45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH6.0-10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为7％(W/V)。利用引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’经PCR扩增该菌株的16SrRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库，其序列号为KX865140，此序列是鉴定该菌株的分子特征依据。1433菌株的主要脂肪酸为异式十五碳饱和脂肪酸，占31.6％，是鉴别该菌的化学特征依据。本专利技术的辣椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株在制备微生物肥料中的应用。本专利技术的微生物肥料按微生物发酵常规方法及生物肥料制备常规方法制成。本专利技术的有益效果在于：1、利用1433菌株制备的微生物肥料对烟草、番茄等有显著的促进生长效果，作物产量增加达20％以上。2、利用1433菌株制备的微生物肥料，能高效促进作物生长，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详述。实施例中的微生物肥料，按微生物发酵常规方法及微生物肥料制备常规方法制成。1.1433菌株产尿素测定尿素含量标准曲线绘制：分别配制质量浓度为20mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L，300mg/L的尿素水溶液。在棕色比色管中加入5.4ml混合试剂(混合试剂配方：120mg氨基硫脲，125mgCe(SO4)2·2(NH4)2SO4，55ml浓硫酸，46ml85％磷酸，380mg4-安替比林，用去离子水定容至1000ml)，在比色管中分别加入100μL各浓度的尿素水溶液，再加入540μL质量浓度为1.2％的二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，绘制尿素浓度与吸光度间的标准曲线并，求得尿素浓度与吸光度间的换算公式。1433菌株培养液尿素含量测定：将1433菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、150rpm培养2天，将培养液于8000rpm下离心10min，取上清液用于尿素含量测定。取5.4ml复合试剂于棕色比色管中，加入100μL上清液和540μL1.2％二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，根据尿素浓度与吸光度间的换算公式求得上清液中的尿素含量；以等体积的牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照。测定结果：根据标准曲线获得尿素浓度(y)与吸光度(x)间的线性关系公式为y＝2672.4x+2.1596(r＝0.9943)。根据此公式，对照牛肉膏蛋白胨培养基中的尿素含量为0，而1433菌株培养液中的尿素含量为327.25mg/L。2.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株产尿素细菌，其特征在于所述的产尿素细菌为辣椒芽孢杆菌(Bacilluszanthoxyli)1433菌株，保藏号：CCTCC No:M 2018369。

【技术特征摘要】
1.一株产尿素细菌，其特征在于所述的产尿素细菌为辣椒芽孢杆菌(Bacilluszanthoxyli)1433菌株，保藏号：CCTCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫明和，祝明亮，茶琦雁，刘子仪，张体坤，王学坚，马莉，夏振远，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53