一种降血糖七肽制造技术

本发明专利技术公开了一种降血糖七肽，所述降血糖七肽的氨基酸序列如下所示：Gly‑Val‑Pro‑Met‑Pro‑Asn‑Lys，缩写为GVPMPNK，分子量741.90Da，纯度为96.1%。本发明专利技术的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。体外α‑淀粉酶和α‑葡萄糖苷酶的抑制活性检测表明，对2种酶都有良好抑制作用，对α‑淀粉酶的50%抑制浓度（IC50）为236.23μg/mL，对α‑葡萄糖苷酶的50%抑制浓度（IC50）为151.46μg/mL。本发明专利技术提供一种降血糖七肽，可应用于生物制药领域。

【技术实现步骤摘要】
一种降血糖七肽
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种合成多肽及其应用。
技术介绍
糖尿病是一种慢性病，是由于体内胰岛素不足引起的蛋白质、脂肪、碳水化合物代谢紊乱，主要特点是慢性高血糖。研究发现有许多天然的抗糖尿病有效成分，譬如：银杏叶提取物、植物多糖等。生物活性多肽的降血糖方面的研究较少。已有的一些研究表明，生物活性肽能有效改善糖尿病的作用。例如，在王军波等的研究中，海洋胶原肽能够缓解高胰岛素血症大鼠的胰岛β细胞的结构损伤，增加颗粒的分泌，减少脂滴的形成，显著提高胰岛素的生物学活性；显著降低的空腹胰岛素水平，对空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作用。在黄凤杰等的研究中，鲨鱼肝活性肽S-8300有抗氧化作用，通过清除自由基保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢，延缓胰岛β细胞的衰竭，在一定程度上能够治疗糖尿病。人体中淀粉等糖类物质的消化吸收，需要依赖α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶这两种关键酶。因此，抑制这两种关键酶的活性便能减缓碳水化合物降解为单糖的速度，以达到调控餐后血糖升高过快的目的。
技术实现思路
本专利技术选取α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶为研究对象，测定合成肽的体外抑制活性。本专利技术的目的是提供一种具有体外降血糖活性的合成多肽，可应用于生物制药领域。本专利技术所述的合成多肽缩写为GVPMPNK，分子量741.9Da，纯度为96.1％，序列为：Gly-Val-Pro-Met-Pro-Asn-Lys。其中，Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；Val表示英文名称为Valine，中文名称为颉氨酸的氨基酸的相应残基；Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；Met表示英文名称为Methionine，中文名称为甲硫氨酸的氨基酸的相应残基；Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基；Lys表示英文名称为Lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基。本专利技术所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。本专利技术通过研究合成肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用来评价其降血糖作用。进一步地，所述七肽GVPMPNK对α-淀粉酶有抑制活性，IC50值为236.23μg/mL。进一步地，所述七肽对α-葡萄糖苷酶的50％抑制浓度(IC50)为151.46μg/mL。进一步地，所述七肽在2.5-5mg/mL浓度范围内，对α-淀粉酶抑制率是78％-83％。进一步地，所述七肽在1-2.5mg/mL浓度范围内，对α-葡萄糖苷酶抑制率是115％-112％。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和技术效果：本专利技术首次合成了该七肽，并且检测了合成多肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，所述合成多肽具有降血糖能力。附图说明图1a为合成多肽Gly-Val-Pro-Met-Pro-Asn-Lys的HPLC图。图1b为合成多肽Gly-Val-Pro-Met-Pro-Asn-Lys的MS图。图2a为合成多肽Gly-Val-Pro-Met-Pro-Asn-Lys对α-淀粉酶的抑制活性曲线。图2b为合成多肽Gly-Val-Pro-Met-Pro-Asn-Lys对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线。具体实施方式以下结合具体实例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术的实施和保护范围不限于此，需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。多肽固相合成选用高分子树脂(中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列Gly-Val-Pro-Met-Pro-Asn-Lys的特征，先将Gly的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Gly的氨基和Val的羧基缩水反应，处理后，再添加Pro，Val的氨基和Pro的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Lys氨基酸后，再切除树脂即得到目标多肽。采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为PhenomenexC18，尺寸4.6*150mm，流动相A:含有0.1％三氟乙酸(TFA)(v/v)的水；流动相B:含有0.09％TFA(v/v)的溶液(80％乙腈+20％水)；20min内B相由14.0％上升到24.0％，流速1.0mL/min，检测波长220nm。液氮速冻，冷冻干燥，得到最后的产品，要求纯度达到95％以上，并经MS鉴定结构(如图1所示)。合成多肽对α-淀粉酶的体外抑制活性1试剂的配制1)0.2M磷酸缓冲液：称取Na2HPO42.84g、KH2PO42.72g分别溶于100mL蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至pH＝6.9，搅拌过程用pH计测量实时酸碱度。2)1U/mL淀粉酶溶液：取淀粉酶4μL，与1996μL蒸馏水混合，配成2mL酶液。3)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉，溶于99mL缓冲液中。4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同剂量的样品溶液(0～10mg/mL)，溶剂为10％DMSO。5)DNS终止反应液：称取1gDNS，12g酒石酸钠钾于锥型瓶中，加入87mL0.4MNa2CO3溶液。6)阿卡波糖溶液：用于阳性对照，称取一定量阿卡波糖配制成不同浓度梯度的溶液(0～8mg/mL)。2实验步骤1)1％淀粉溶液95℃水浴8min，预处理使其变性。2)实验组用移液枪吸取抑制剂(0～10mg/mL)20μL与酶液10μL于试管中混合，对照组缓冲液20μL与酶液10μL混合，阳性对照组取阿卡波糖(0～8mg/mL)20μL与酶液10μL混合，于37℃摇床反应15min。3)加入经预处理的淀粉溶液500μL，于37℃摇床反应5min。4)加入DNS溶液600μL，100℃水浴15min。5)反应结束后，用移液枪吸取200μL反应液，于540nm测吸光度,实验组与对照组分别用A实验组与A对照组表示。合成多肽对α-葡萄糖苷酶的体外抑制活性1试剂的配制1)0.2M磷酸缓冲液：称取Na2HPO42.84g、KH2PO42.72g分别溶于100mL蒸馏水中，取适量的两种溶液在磁力搅拌器的作用下混合至pH＝6.9，搅拌过程用pH计测量实时酸碱度。2)P-NPG溶液：底物溶液，称取0.003765gp-NPG,溶于15mL蒸馏水中。3)0.2U/mLα葡萄糖苷酶液：吸取已分装的酶液(200U/ml)5μL，用蒸馏水配成5mL。4)样品溶液：取一定质量的样品，配置成不同浓度的样品溶液(0～10mg/mL)，溶剂为10％DMSO。5)0.2MNa2CO3：称取0.848gNa2CO3，溶于40mL蒸馏水中。2实验步骤1)于96孔板中反应，实验组、背景组、对照组、阳性对照组添加试剂如表1所示，于37℃摇床反应20min。表1样品的添加量2)各孔中加入缓冲液50μL，底物溶液40μL，于37℃摇床反应20min后去除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降血糖七肽，其特征是该七肽的氨基酸序列为Gly‑Val‑Pro‑Met‑Pro‑Asn‑Lys，缩写为GVPMPNK。

【技术特征摘要】
1.一种降血糖七肽，其特征是该七肽的氨基酸序列为Gly-Val-Pro-Met-Pro-Asn-Lys，缩写为GVPMPNK。2.如权利要求1所述的一种降血糖七肽，其特征在于所述七肽GVPMPNK对α-淀粉酶有抑制活性，IC50值为236.23μg/mL。3.如权利要求1所述的一种降血糖七肽，其特征在于所述七肽对α-葡萄糖苷酶的50%抑制浓度（IC50）为151.46...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学武，赵冰丽，胡双飞，范晓丹，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44