基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法技术

本发明专利技术公开了基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法，包括以下步骤：（1）褐菖鲉基因组DNA提取：利用苯酚/氯仿/异戊醇方法提取褐菖鲉基因组DNA；（2）Adapter接头设计：合成一对通用接头序列、样品标签序列和一对PCR引物序列；（3）褐菖鲉基因组DNA用MseI和NlaIII进行酶切；（4）连接Adapter；（5）混合样品和PCR扩增；（6）回收序列片段和高通量测序；（7）数据分析开发SNP位点。有益效果为：本发明专利技术分子标记方法技术稳定、重复性高、能够在降低成本的情况下大量开发基因组分子标记。

【技术实现步骤摘要】
基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法
本专利技术涉及褐菖鲉基因组分子标记开发
，尤其是涉及基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法。技术背景分子标记是能区分生物种间、种内群体间及群体内个体间遗传差异的DNA序列片段。利用分子标记能够开展物种鉴别、遗传多样性评估、遗传分化监测和个体分类聚群等科学研究。目前使用较为广泛的分子标记有线粒体DNA（mitochondrialDNA）、微卫星标记（simplesequencerepeat,SSR）、单核苷酸多态位点（singlenucleotidepolymorphism,SNP）等。随着高通量测序技术和生物信息学分析方法的发展，分子遗传学研究要求分子标记需具有成本低、遗传信息量大、基因分型效率高等特点。因而SNP标记越来越成为重要的分子标记。相对于线粒体DNA和SSR标记而言，SNP标记具有数据量大、覆盖度高、分型效率高等特点。SNP广泛分布在基因组编码区和非编码区，借助高通量测序技术能够在低成本的情况下开发得到数以万计的标记位点。随着测序技术的发展和测序成本的降低，SNP标记已经成为群体遗传、基因分型和物种鉴定的主要标记方法。基因分型测序技术（genotyping-by-sequencing,GBS）是一种低成本的简化基因组测序技术（reduced-representationsequencing），能够在基因组范围内开发大量SNP标记用于基因分型。由于不依赖参考基因组、测序流程简单、测序成本低等特点，GBS技术已广泛应用于非模式生物分子标记开发、遗传图谱绘制、关联分析和群体基因组学等研究。褐菖鲉是一种广泛分布于西北太平洋海域的岩礁性卵胎生鱼类，具有重要的经济价值和生态价值。目前褐菖鲉的分子标记仅局限于线粒体DNA和微卫星标记，分子标记的局限性严重影响了褐菖鲉群体遗传多样性和遗传结构的监测，导致划分渔业管理单元和制定管理策略出现偏差，最终影响褐菖鲉渔业资源的合理开发利用。基于上述原因，有必要提供一种新的开发褐菖鲉基因组SNP位点的分析方法，在降低成本的前提下开发大量分子标记，为后续基因分型和遗传学研究提供便利。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种技术稳定、重复性高、能够在降低成本的情况下大量开发基因组分子标记的基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法，包括以下步骤：褐菖鲉基因组DNA提取：利用苯酚/氯仿/异戊醇方法提取褐菖鲉基因组DNA；Adapter接头设计：合成一对通用接头序列、样品标签序列和一对PCR引物序列；褐菖鲉基因组DNA用MseI和NlaIII进行酶切；连接Adapter；混合样品和PCR扩增；回收序列片段和高通量测序；数据分析开发SNP位点。本专利技术分子标记方法可以在褐菖鲉基因组水平上开发SNP分子标记，SNP覆盖基因组编码区和非编码区，基因分型测序技术是一种低成本的简化基因组测序技术，能够在基因组范围内开发大量SNP标记用于基因分型，而使用MseI和NlaIII的基因分型测序技术大大降低了分子标记开发的成本，开发得到的SNP位点可应用于褐菖鲉的种质资源评估、遗传多样性和遗传结构监测等研究，该SNP分子标记方法技术稳定，重复性高。作为优选，褐菖鲉基因组DNA提取步骤为：（a）将肌肉样品去除酒精后置于1.5ml离心管中，加入600-700μl消化缓冲液和18-22μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于50-60℃烘箱内消化4-6h，每30min摇晃一次；（b）将步骤a消化好的溶液冷却至室温后，于离心管中加入等体积的平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，在10000-15000rpm条件下离心10-15min，然后重复上述步骤2-3次；（c）将步骤b得离心上清液体中加入等体积-20℃预冷酒精，振动至DNA沉淀下来，然后在2-5℃、10000-15000rpm条件下离心5-10min后，离心沉淀用250-350μl浓度为70-80%酒精溶液漂洗两次，然后在10000-15000rpm条件下离心5-10min后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，最后将提取的DNA溶液置于4℃冰箱保存，待用。本专利技术利用苯酚/氯仿/异戊醇方法提取褐菖鲉基因组DNA，对褐菖鲉基因组DNA的损伤比较小，容易获得完整性相对更好的褐菖鲉基因组DNA，同时可在加异丙醇后冰浴10-20分钟后离心，效果更佳。作为优选，Adapter接头的设计与MseI和NlaIII的酶切末端和后续IlluminaHiseq测序平台要求的引物序列一致，所述Adapter接头序列由Illumina测序平台接头序列、样品标签序列两部分组成。进一步优选，样品标签序列设计原则如下：（a）样品标签序列为6碱基序列且不能含有连续两个相同的碱基；（b）样品标签序列间必须有至少两个差异碱基；（c）样品标签不能与酶切位点相同或相近。作为优选，褐菖鲉基因组DNA用MseI和NlaIII进行酶切的具体步骤为：取0.1-1μg褐菖鲉基因组DNA，用MseI和NlaIII酶切组合进行酶切，以得到适合的标记密度。采用MseI和NlaIII酶切组合酶的酶切位点分布广泛且均匀，对褐菖鲉基因组DNA进行酶切，产生的酶切标签具有较高的多样性，可满足筛查SNP以进行遗传作图的要求。作为优选，连接Adapter的具体步骤为：Adapter接头连接与褐菖鲉基因组DNA用MseI和NlaIII进行酶切在同一试管中进行，接头通过连接酶与DNA酶切末端相连接。作为优选，混合样品和PCR扩增的具体步骤为：将连接Adapter接头的不同样品DNA片段等量混合，加入PCR引物序列和DNA合成酶进行PCR扩增。作为优选，回收序列片段和高通量测序的具体步骤为：电泳回收步骤（4）中扩增的产物，利用IlluminaHiseq2000测序平台进行测序。高通量测序开发方法简单易行、清晰准确、假阳性低并且试验成本低，扩增区内已知和未知SNP都能检测；灵敏度和精确度达到近100%。作为优选，数据分析开发SNP位点的具体步骤为：测序得到的原始数据按照样品标签序列进行分选聚类，按样品个体进行数据质控并删除Adapter接头序列，利用短序列比对软件BWA将序列比对到参考基因组上，使用SAMtools软件提取SNP位点，使用VCFtools软件筛选用于群体遗传结构分析的SNP位点。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术分子标记方法可以在褐菖鲉基因组水平上开发SNP分子标记，SNP覆盖基因组编码区和非编码区，基因分型测序技术是一种低成本的简化基因组测序技术，能够在基因组范围内开发大量SNP标记用于基因分型，而使用MseI和NlaIII的基因分型测序技术大大降低了分子标记开发的成本，开发得到的SNP位点可应用于褐菖鲉的种质资源评估、遗传多样性和遗传结构监测等研究，该SNP分子标记方法技术稳定，重复性高。附图说明图1：本专利技术实例例2中利用开发的褐菖鲉基因组SNP位点进行群体遗传结构分析。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）褐菖鲉基因组DNA提取：利用苯酚/氯仿/异戊醇方法提取褐菖鲉基因组DNA；（2）Adapter接头设计：合成一对通用接头序列、样品标签序列和一对PCR引物序列；（3）褐菖鲉基因组DNA用MseI和NlaIII进行酶切；（4）连接Adapter；（5）混合样品和PCR扩增；（6）回收序列片段和高通量测序；（7）数据分析开发SNP位点。

【技术特征摘要】
1.基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）褐菖鲉基因组DNA提取：利用苯酚/氯仿/异戊醇方法提取褐菖鲉基因组DNA；（2）Adapter接头设计：合成一对通用接头序列、样品标签序列和一对PCR引物序列；（3）褐菖鲉基因组DNA用MseI和NlaIII进行酶切；（4）连接Adapter；（5）混合样品和PCR扩增；（6）回收序列片段和高通量测序；（7）数据分析开发SNP位点。2.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述褐菖鲉基因组DNA提取的具体步骤为：（a）将肌肉样品中加入600-700μl消化缓冲液和18-22μl蛋白酶K溶液，震荡混匀后置于50-60℃下消化4-6h；（b）将步骤a消化好的溶液冷却至室温后，加入等体积的平衡酚，摇晃混匀至乳状溶液，离心，然后重复上述步骤2-3次；（c）将步骤b得离心上清液体中加入等体积-20℃预冷酒精，振动至DNA沉淀下来，离心，离心沉淀用250-350μl浓度为70-80%酒精溶液漂洗两次，离心后弃上清液，晾干后在离心管中加入100μl去离子水，溶解DNA，待用。3.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述Adapter接头的设计与MseI和NlaIII的酶切末端和后续IlluminaHiseq测序平台要求的引物序列一致，所述Adapter接头序列由Illumina测序平台接头序列、样品标签序列两部分组成。4.根据权利要求1所述的基于酶切组合基因分型测序技术的褐菖鲉基因组SNP分子标记方法，其特征在于：所述样品标签序列设计原则如下：（a）样品标签序列为6碱基序列且不...

【专利技术属性】
技术研发人员：高天翔，徐胜勇，陈治，杨天燕，蔡珊珊，赵林林，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33