一种发酵豆粕指纹图谱构建方法及其在品质控制中的应用技术

本发明专利技术属于发酵工程与分析化学综合的技术领域，公开了一种发酵豆粕指纹图谱构建方法及其在品质控制中的应用。本发明专利技术首次利用HLPC法构建了发酵豆粕指纹图谱，对十批产品进行检测，得到发酵豆粕指纹图谱模式，确立了11个共有组份，并对3种组份进行了定性，为柠檬酸、乳酸、乙酸。该方法可以特异性的评判发酵豆粕，能够鉴别酶解豆粕或者参假发酵豆粕，稳定发酵豆粕品质。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵豆粕指纹图谱构建方法及其在品质控制中的应用
本专利技术属于发酵工程与分析化学综合的
，具体涉及一种发酵豆粕指纹图谱构建方法及其在品质控制中的应用。
技术介绍
发酵豆粕技术自上世纪九十年代从国外引进并加以创新后，经过二十多年的发展，现已日趋成熟，发酵豆粕目前在国内处于大规模产业化的上升期，在市场上有广阔的需求，生产发酵豆粕的厂家已有几十家企业，目前产量接近100万吨，成为可以替代鱼粉的重要蛋白质饲料原料。但各个厂家生产发酵豆粕的工艺各式各样，没有统一的标准，生产出的发酵豆粕产品品质量参差不齐(葛向阳，2010),目前行业内推行的发酵豆粕质量评判标准主要以抗营养因子降解程度、酸溶蛋白提高程度以及蛋白溶解度等常规指标为主(朱滔，2017)，有很好的参考价值但也存在一定的局限性。市场上发酵豆粕产品掺假的现象屡见不鲜，比如掺入小分子含氮物，氨基酸渣、劣质蛋白原料等，而利用发酵豆粕的标准中规定生物常规指标含量评价真伪和优劣就行不通。发酵豆粕的主要功能体现在一下四个方面：一是将豆粕中的大分子蛋白降解为小分子蛋白、多肽和游离氨基酸等更容易被动物体吸利用的物质，提高饲料转化率；二是降解豆粕中的抗营养因子，极大降低饲料的抗原性，提高豆粕的安全性能；三是接种的有益菌大量生长繁殖，使发酵豆粕中的有益菌活菌数达到很高的含量，饲喂动物后有利于维持动物体内的肠道平衡，抑制有害病原菌的生长，提高动物免疫性能。四是产生丰富有益的代谢产物，比如有机酸、多肽和维生素等，进一步提高发酵豆粕的营养价值，特别是能产生一些对动物生具有明显促生长作用、不可或缺的生长因子。对于降解大分子蛋白质产生小分子蛋白质，是豆粕发酵的重要目的之一，但该过程通过酶解可以完全达到，甚至更好。如果说发酵豆粕纯粹追求小肽含量，偏离了本质，因为动物体内就可以完成这个过程，或者外加蛋白酶直接饲喂就可以达到更好的效果。消除抗原或抗营养因子，客观的讲，物理或化学的方法会比发酵酶解效果好很多，效率也高。纯发酵酶解，对抗原抗营养因子的消除能达到50％以上，而大豆浓缩蛋白，其抗原、抗营养因子比发酵豆粕低很多。更何况大豆经过了压榨、干燥处理后，其抗原、抗营养因子已经大幅降低，也正是因为这样，豆粕是长期作为优质饲用蛋白质原料的基础。产生有益菌，也是发酵豆粕的目的之一。目前微生态制剂工艺技术和产品都很成熟，有益菌完全可以通过较低的成本添加获得。豆粕通过微生物发酵，产生了一系列丰富有益的代谢产物，这些代谢产物成分极其复杂，并且很多成分的分子结构和理化性质尚不清楚,对代谢产物的检测用常规方法难以实施，但代谢产物对发酵豆粕营养价值的提升具有重要作用，是评判发酵豆粕产品品质的重要指标，所以应寻求另外特殊的方法，从代谢产物这个角度建立发酵豆粕的质量评价标准，从而对发酵豆粕产品品质做到更有效的监控。发酵豆粕的本质特性就是丰富的有益代谢产物，这也是鉴别发酵豆粕与酶解豆粕或者其他配制的“发酵豆粕”的有效方法。指纹图谱技术来源于对传统中药的评价和品质控制。传统中药成分极其复杂，发挥药效作用的并不是由单一或几种化合物决定的，中药中的多种组分在多种机制下协同作用，从而产生疗效。指纹图谱就是基于对中药成分整体性的作用，利用色谱、波普等现代科学分析技术获得其成分的相关图谱，对已知和未知的成分进行分析。根据相对保留时间和相对峰面积表征化学成分的信息，具有特异性、整体性和模糊性，实现全面评价中药的质量品质，确保其质量稳定、均一，已广泛应用到中药的鉴别和质量控制(李强，2013)。史晓飒等用HPLC-PAD法对9批不同产地蝉花药材进行分析，共标定了14个共有峰，进行相似性评价，相似性大多都在0.95以上，建立了蝉花的指纹图谱，能更好地综合评价蝉花药材的质量(史晓飒，2017)。陈文等用高效液相色谱法对11批不同产地的麦冬进行分析，标定了25个共有峰，各个批次的麦冬相似度度都在0.99以上，可以作为麦冬质量控制的依据(陈文，2018)。豆粕发酵过程中微生物代谢，并对蛋白质进行分解和重组，从而形成新的物质，这些代谢产物包括有机酸、多糖、新的肽类，核苷酸类和色素等,将发酵豆粕的真正价值开发出来。借用中药指纹图谱的研究手段，对代谢产物中的有机酸进行分析和定量，便于更好的稳定和改进发酵豆粕工艺。运用高效液相色谱法(HPLC),构建发酵豆粕指纹图谱，该图谱具有唯一性，能从整体上有效地鉴别发酵豆粕的品质，促进发酵豆粕产品的质量评判标准规范统一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术的不足，提供了一种发酵豆粕指纹图谱构建方法。本专利技术的另一个目的在于提供了一种发酵豆粕指纹图谱构建方法在品质控制中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种发酵豆粕指纹图谱构建方法，包括下述步骤：1)5g发酵豆粕产品加入45ml蒸馏水，200rpm摇床振荡30min,10000rpm离心10min,取100ul样液，用5mM的H2SO4稀释10倍，然后用注射器过0.22um膜,收集于2ml进样瓶；2)高效液相色谱仪检测色谱柱：Bio-AminexHPX-87Hion-exclusioncolumn(300mmx7.8mm，4.5um)；流动相：5mmol/LH2SO4，等度洗脱；柱温：40℃；流速：0.6ml/min；检测波长：210nm；进样量：20u，记录分析时间30min。以上所述的方法中，优选的，所述的发酵豆粕的制备方式如下：豆粕5000kg,水3000kg，枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母接种量分别为0.5*108cfu/g豆粕、0.2*108cfu/g豆粕、1*108cfu/g豆粕，中性蛋白酶添加量为50u/g豆粕，控制温度35-40℃，发酵60-72h，干燥。以上所述的方法中，优选的，所述的枯草芽孢杆菌为CCTCCNO:M2012418、所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌MCJ、所述的酿酒酵母为CCTCCNO:M2013321。与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：1.本专利技术首次利用HLPC法构建了发酵豆粕指纹图谱，对十批产品进行检测，得到发酵豆粕指纹图谱模式，确利了11个共有组份，并对其中相对保留时间分别在第8.309min、12.911min、15.586min的3种组份进行了定性，为柠檬酸、乳酸、乙酸。2.本专利技术构建的指纹图谱用于发酵豆粕产品检测，可以特异性的评判发酵豆粕，能够鉴别酶解豆粕或者参假发酵豆粕，稳定发酵豆粕品质。构建的发酵豆粕指纹图谱可以用于发酵豆粕产品稳定性的评价和真伪鉴别。采用相同的发酵工艺生产的发酵豆粕指纹图谱与构建的指纹图谱相似度大于95％，不同发酵工艺生产的发酵豆粕指纹图谱与构建的指纹图谱相似度大于90％，酶解豆粕或者在豆粕原料中参入其他原料的相似度低于90％。附图说明图1为10批发酵豆粕HPLC指纹图谱。图2为10批发酵豆粕指纹图谱共有模式。图3为不同发酵工艺发酵豆粕HPLC指纹图谱。具体实施方式下面对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术实施例所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：一种发酵豆粕指纹图谱构建方法，包括下述步骤：1)发酵豆粕样品制备：商品豆粕5000kg(含水量12％)，水3000kg，枯草芽孢杆菌CCTCCN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵豆粕指纹图谱构建方法，包括下述步骤：1）5g发酵豆粕产品加入45ml蒸馏水，200rpm摇床振荡30min,10000rpm离心10min,取100ul样液，用5mM的H2SO4稀释10倍，然后用注射器过0.22um膜,收集于2ml进样瓶；2）高效液相色谱仪检测色谱柱：Bio‑Aminex HPX‑87H ion‑exclusion column（300mm x 7.8mm，4.5um）；流动相：5mmol/L H2SO4，等度洗脱；柱温：40℃；流速：0.6ml/min；检测波长：210nm；进样量：20u，记录分析时间30min。

【技术特征摘要】
1.一种发酵豆粕指纹图谱构建方法，包括下述步骤：1）5g发酵豆粕产品加入45ml蒸馏水，200rpm摇床振荡30min,10000rpm离心10min,取100ul样液，用5mM的H2SO4稀释10倍，然后用注射器过0.22um膜,收集于2ml进样瓶；2）高效液相色谱仪检测色谱柱：Bio-AminexHPX-87Hion-exclusioncolumn（300mmx7.8mm，4.5um）；流动相：5mmol/LH2SO4，等度洗脱；柱温：40℃；流速：0.6ml/min；检测波长：210nm；进样量：20u，记录分析时间30m...

【专利技术属性】
技术研发人员：李苏，葛向阳，王格，吴晓峰，
申请(专利权)人：湖北邦之德牧业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42