本发明专利技术提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记及其引物，其引物包括Allele‑T引物、Allele‑C引物和Common‑R引物，所述Allele‑T引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述Allele‑C引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述Common‑R引物的序列如SEQ ID NO：3所示。采用本发明专利技术的技术方案的荧光分子标记，实现了快速检测水稻品种中是否含有抗稻瘟病等位基因Pigm；方法简单可靠，解决了目前使用的方法存在效率低，使用有毒物质的缺点，可应用在水稻抗稻瘟病Pigm等位基因的检测和/或水稻抗稻瘟病的辅助选择育种中。
【技术实现步骤摘要】
一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记及其引物
本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记及其引物。
技术介绍
水稻作为重要的粮食作物之一，哺育了全球近50%的人口。随着水稻基因组测序和精细遗传图谱的完成，对水稻的功能基因研究已成为水稻科研人员的重要研究内容。功能基因分子标记的开发和利用在水稻分子育种上发挥了重要的作用，对农业经济的发展有重要的推动作用。水稻稻瘟病（riceblast）是由子囊菌(Magnaportheoryzae)引起的真菌危害性病，是影响水稻的产量最大的病害之一，严重时使水稻减产40%~50%，甚至达到颗粒无收的程度。目前农业生产上控制稻瘟病害方法主要是化学防治和种植抗稻瘟病品种防治。化学防治方法虽然在一定程度上能减少稻瘟病对水稻产量的损失，但是大量使用农药会造成田间环境污染，甚至增加稻米的农药残留量，因而种植抗病水稻品种是防治稻瘟病爆发的最经济、安全的方式。Pigm基因来源于水稻品种谷梅4号中的一个持久广谱抗稻瘟病基因，已被定位到水稻第6染色体短臂上靠近Pi2/9位点，该基因由多个NBS-LRR类抗病基因组成，其中PigmS和PigmR是2个有功能蛋白，它们通过竞争形成异源二聚体，使PigmR的致病性进化减慢，从而达到持久抗病。目前Pigm基因已被越来越多的水稻育种研究者用于分子标记辅助选择技术进行抗稻瘟病水稻品种选育。目前已有研究者开发Pigm的分子标记，PCR扩增后通过琼脂糖电泳区分该基因及其等位基因，并用于分子标记辅助选择育种。但是目前此方法需要进行琼脂糖电泳，效率低，而且需要使用有毒的核酸染料。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记及其引物，提供了一种简单可靠的方法就实现了快速检测水稻品种中是否含有抗稻瘟病等位基因Pigm；解决了目前使用的方法效率低，使用有毒物质的缺点。对此，本专利技术采用的技术方案为：一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的引物，包括Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R引物，所述Allele-T引物的序列如SEQIDNO：1所示，所述Allele-C引物的序列如SEQIDNO：2所示，所述Common-R引物的序列如SEQIDNO：3所示，具体而言，引物的序列如下：Allele-T：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAACGTAAAGTGGAGGAACCT；Allele-C：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAACGTAAAGTGGAGGAACCC；Common-R：GGAGGTGCTAGAGTTTGTCGCC。将上述引物用于PCR扩增，含有Pigm等位基因的水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得HEX荧光信号，而不含Pigm等位基因的水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM荧光信号。方法简单可靠，能快速检测水稻品种中是否含有抗稻瘟病等位基因Pigm。因为不需要电泳检测，直接用荧光扫描仪获取扩增数据，所以解决目前现有技术使用的方法因存在效率低，使用有毒物质的缺点。本专利技术公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记，其采用Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R引物获得。进一步优选的，所述水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的方法为：采用Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R对水稻植株中的Pigm基因进行扩增，在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，如果扫描获得HEX荧光信号，则为含基因Pigm；如果扫描获得FAM荧光信号，则为不含Pigm等位基因。采用此技术方案，上述3条引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，抗稻瘟病等位基因Pigm序列可以根据SNP差异与正向引物Allele-T匹配而扩增获得HEX荧光信号值；而感稻瘟病等位基因序列与正向引物Allele-C匹配而扩增获得FAM荧光信号值。进一步优选的，所述的水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记采用以下步骤实施：步骤S1，提取水稻植株的基因组DNA；步骤S2，将Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R引物同时加入到PCR反应体系中进行扩增获得PCR产物；其中PCR的反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃、20sec，65℃、1min，每循环-0.8℃；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min；步骤S3，将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果；步骤S4，对荧光强度信号值进行分析，如果扫描获得HEX荧光信号，则为含基因Pigm；如果扫描获得FAM荧光信号，则为不含Pigm等位基因。进一步优选的，步骤S2中，PCR反应体系为10μL的体系：5μL2×PARMSmastermix，0.15μL10mMAllele-T引物，0.15μL10mMAllele-C引物，0.4μL10mMCommon-R引物，1μL模板DNA，3.3μLddH2O。进一步优选的，5μL2×PARMSmastermix中包含2条通用荧光引物。本专利技术公开了一种如上所述的水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的应用，其应用在水稻抗稻瘟病Pigm等位基因的检测和/或水稻抗稻瘟病的辅助选择育种中。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术基于Penta-primeramplificationrefractorymutationsystem（PARMS）技术，及Pigm序列与其等位基因Pi2、Pi9及感病品种日本晴中的等位基因的序列差异，开发了能跟踪抗稻瘟病的共显性荧光分子标记PM-Pigm（由3条引物构成，分别为Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R引物），通过PCR扩增，不需要电泳检测，而直接用荧光扫描仪获取扩增数据，方法简单可靠，检验快速；将数据经过分析，获得水稻Pigm的基因型数据，可筛选抗性基因Pigm应用到培育具有抗稻瘟病的水稻新品种上。附图说明图1是本专利技术的抗稻瘟病等位基因Pigm的扩增示意图；其中，#1，Allele1HEX荧光通用引物；#2，Allele2FAM荧光通用引物；#3，Allele1特异扩增引物（标记引物）；#4，Allele2特异扩增引物（标记引物）；#5，通用反向引物（标记引物）。图2是本专利技术检测的48个水稻亲本品种分子标记的基因分型结果图。具体实施方式下面对本专利技术的较优的实施例作进一步的详细说明。一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记，其具体实施步骤如下：（1）提取水稻基因组DNA分别取水稻叶片，通过CTAB提取法（十六烷基三甲基溴化铵法）获得水稻的基因组DNA；（2）PCR扩增将3条引物Allele-T、Allele-C和Common-R同时加入到PCR反应体系中，并对所述的水稻植株中的Pigm基因进行扩增得到PCR产物。其中，引物Allele-T、Allele-C和Common-R的引物序列如下：Allele-T：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAACGTAAAGTGGAGGAACCT；Allel本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的引物，其特征在于：包括Allele‑T引物、Allele‑C引物和Common‑R引物，所述Allele‑T引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述Allele‑C引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述Common‑R引物的序列如SEQ ID NO：3所示。
【技术特征摘要】
1.一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的引物，其特征在于：包括Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R引物，所述Allele-T引物的序列如SEQIDNO：1所示，所述Allele-C引物的序列如SEQIDNO：2所示，所述Common-R引物的序列如SEQIDNO：3所示。2.一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记，其特征在于：其采用如权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记的引物获得。3.根据权利要求2所述的水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记，其特征在于：采用Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R对水稻植株中的Pigm基因进行扩增，在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，如果扫描获得HEX荧光信号，则为含基因Pigm；如果扫描获得FAM荧光信号，则为不含Pigm等位基因。4.根据权利要求3所述的水稻抗稻瘟病基因Pigm的荧光分子标记，其特征在于：其采用以下步骤实施：步骤S1，提取水稻植株的基因组DNA；步骤S2，将Allele-T引物、Allele-C引物和Common-R引物同时加入到PCR反应体系中进行扩增获得PCR产物；其中PCR的反应程序为：9...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓国富，卿冬进，戴高兴，高利军，黄娟，高菊，梁海福，伍豪，周维永，周萌，陈韦韦，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西,45
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