含萘酰亚胺的小分子作为荧光探针在RNA检测和成像方面的应用制造技术

本发明专利技术属于细胞成像技术领域，具体为一种含萘酰亚胺的小分子作为荧光探针在RNA检测和成像方面的应用。所述含萘酰亚胺的小分子化合物，与RNA结合有荧光增强的响应，但在相同条件下对DNA的响应很弱，表明其在溶液状态具有很好的选择性，可作为分辨RNA与DNA的探针，在溶液状态下和活体细胞中排除DNA干扰选择性识别RNA；而且该小分子化合物能够在两分钟内快速穿过活体细胞的细胞膜和核膜，实现对细胞质和细胞核内RNA的荧光成像，并具有良好的生物兼容性。

【技术实现步骤摘要】
含萘酰亚胺的小分子作为荧光探针在RNA检测和成像方面的应用
本专利技术属于荧光探针
，具体涉及一种含萘酰亚胺的荧光探针在RNA检测和成像方面的应用。该探针在磷酸缓冲液和细胞中均可排除DNA干扰选择性识别RNA；在活细胞中，化合物可以快速穿过细胞膜和核膜实现对细胞质和细胞核内所有RNA的荧光成像。
技术介绍
RNA是以DNA的一条链为模版，以碱基互补配对为原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表达转化的桥梁，另外RNA也参与细胞内化学反应的调节与催化。RNA表达量的变化与表达位置的改变是生物体发生代谢异常的重要标志。因此在活细胞内成像RNA不仅有助于了解生命活动的本质而且可提高疾病检测的准确性。目前，成像细胞内源性RNA的探针主要可以分为四类：(1)荧光标记的原位杂交探针（FISH），是带有荧光团标记的一段核酸序列，其序列与靶向RNA的不同部分互补。它们是一种发展成熟的成像技术，但是该方法背景较高，且只能在固定细胞中成像。(2)分子信标（MBs），分子信标在未识别RNA时，不具有荧光；结合RNA后，荧光恢复。它们解决了原位杂交探针背景信号高的问题，但是该类材料很难进入活细胞。(3)纳米分子信标，是指加载纳米颗粒的分子信标。纳米颗粒同时作为淬灭剂和载体可降低合成成本。(4)小分子荧光探针，有机小分子类化合物。其优点是合成简单，荧光光谱性质可调，具有很大的发展潜力。现存的小分子RNA荧光探针主要包括菁类染料和有机金属配合物两大类。在成像活细胞内RNA时，普遍存在两个问题：（1）选择性不高，尤其是针对与RNA结构类似的DNA来说。很难找到一类荧光探针能很好的区分两者；（2）透膜性较差，即这些探针很难穿过细胞膜和核膜进行快速RNA成像，在成像时需要较长的培养时间，这就限制了对RNA动力学的追踪。同时菁类染料由于其本身的结构特点，存在斯托克位移较小和易光漂白等特点。有机金属配合物因为本身带有正电荷的结构特点，很难区分带负电的RNA和DNA。因此发展其他类别的有机小分子RNA探针是非常需要的。萘酰亚胺类化合物由于光稳定性好，斯托克位移较大，一直是一类不错的荧光探针。但现存的萘酰亚胺类化合物还没有对RNA响应的报道。我们发现了一类RNA荧光探针，这一探针可以与RNA有荧光增强的响应，而与DNA的响应较弱。同时，这一探针可快速进入活细胞，实现对细胞内RNA的荧光成像。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含萘酰亚胺的小分子化合物，作为荧光探针在RNA检测和成像方面的应用。本专利技术涉及的含萘酰亚胺的小分子化合物，以萘酰亚胺为荧光母体，其4位进行胺基修饰，萘酰亚胺母体上的氮原子与游离的氨基化合物共价连接；其结构式为：分子通式为：[R1R2N-C12NO2-R3-NH2]；式中，R1，R2,R3为含1-8个碳的烷基链、卤素取代的烷基链或者醚氧链。实验表明，所述含萘酰亚胺的小分子化合物，与RNA结合有荧光增强的响应，但在相同条件下对DNA的响应很弱，表明其在溶液状态具有很好的选择性，可作为分辨RNA与DNA的探针，在溶液状态下和活体细胞中排除DNA干扰选择性识别RNA。实验表明，所述含萘酰亚胺的小分子化合物，在活细胞中，能够在两分钟内快速穿过活体细胞的细胞膜和核膜，实现对细胞质和细胞核内RNA的荧光成像，并具有良好的生物兼容性。首先，考察该小分子化合物在磷酸缓冲液中与贝克酵母菌RNA滴定的荧光光谱，见图1。发现该化合物随着贝克酵母菌RNA的加入，荧光强度有持续性增强，最终增强至原来的34倍，同时最大发射波长由545纳米蓝移至532纳米，说明此化合物对RNA有荧光增强的响应，且最大发射波长蓝移。图2为相同条件下，该化合物与DNA的荧光滴定光谱，图2显示荧光强度随着小牛胸腺DNA的加入也有增强，但是最终只有5倍左右的增加，并且最大发射波长没有随DNA的加入而发生位移。综合图1和图2说明：相对于DNA，该化合物对RNA具有更好的荧光响应特性，最大发射波长的不同表明，化合物与DNA和RNA以不同的结合方式相互作用。然后，进行活细胞成像试验，参见图3。试验表明：该化合物在30秒内就可以穿过细胞膜和核孔，实现对核仁的染色，且核仁荧光在60秒内达到饱和，随着时间的推移，细胞质内点状的荧光逐渐增强，并且在120秒内达到饱和。这一实验说明，此化合物是一种快速成像的探针。图4为RNA酶验证探针在细胞内的选择性试验结果。图4上显示与RNA酶共培养的细胞，细胞的整体荧光强度有更明显的降低；而与DNA酶共培养的细胞，荧光强度降低较小。图4下显示RNA活细胞商用探针Syto与此探针具有相同的倾向性。这一结果可说明，探针更容易被RNA酶降解。Syto是商用的RNA探针，在细胞中对RNA的选择性较高。本专利技术的探针也在细胞中具有相似的选择性。图5为用MTT法测试探针在宫颈癌细胞中的细胞毒性试验结果。细胞在实验浓度内与宫颈癌细胞共孵育6小时，细胞的存活率都在90%以上。这说明探针对宫颈癌细胞基本没有毒性，证实了探针的生物兼容性。本专利技术的优点是：该小分子化合物具有RNA特异响应的优势，能够区分RNA和DNA。探针在磷酸缓冲液中，可以选择性与RNA响应，荧光增强至原来的34倍，而相同条件下对DNA只有5倍的增强，可区分溶液中的RNA和DNA。在活细胞成像研究中，此探针可在2分钟内快速进入活细胞，实现活细胞内RNA快速荧光成像。RNA酶降解实验验证了探针不但在水溶液中具有较好的选择性，在细胞成像的时候依然具有较好的选择性。同时，此探针对HeLa细胞具有较高的细胞存活率，展示了此探针的生物兼容性。附图说明图1为探针分子C对RNA的荧光滴定光谱。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm，探针的浓度为10μM，测试条件为pH7.2的20mM磷酸缓冲液，RNA的浓度以平均分子量25000道尔顿计量。图2为探针分子C对RNA的选择性。展示了探针在相同条件下与DNA的荧光滴定光谱。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至650nm，探针C的浓度为10μM，测试条件为pH7.2的20mM磷酸缓冲液，DNA的浓度以平均分子量25000道尔顿计量。图3为探针C在HeLa细胞内的活细胞成像。探针浓度为5μM，加DMEM高糖培养基溶解后与HeLa细胞在37℃共培养。选用488nm的激光器，收集波段为515至565nm。照片为加探针与HeLa细胞共培养0秒，30秒，60秒，90秒，120秒的荧光照片和明场照片。图4为RNA酶降解实验。将HeLa细胞铺于6孔板，加5μM探针C共培养5分钟后，用冰甲醇固定细胞，分别用RNA酶或DNA酶与细胞共培养4小时。分别拍摄未处理，加DNA酶处理，加RNA酶处理的荧光照片。选用488nm的激光器，收集波段为515至565nm。图5为用MTT法测试探针分子C在宫颈癌细胞中的细胞毒性。分别验证了探针浓度为0，1，2.5，5，7.5，10，15，20和30μM与HeLa细胞共孵育6小时的细胞存活率。图6为探针分子D（R1=R2=CH3，R3=CH2CH2CH2CH2CH2CH2）对RNA的荧光滴定光谱。荧光光谱的激发波长为450nm，发射波长的收集范围为470至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.含萘酰亚胺的小分子作为荧光探针在RNA检测和成像方面的应用，该含萘酰亚胺的小分子化合物，以萘酰亚胺为荧光母体，其4位进行胺基修饰，萘酰亚胺母体上的氮原子与游离的氨基化合物共价连接；其结构式为：

【技术特征摘要】
2018.04.01 CN 20181028005651.含萘酰亚胺的小分子作为荧光探针在RNA检测和成像方面的应用，该含萘酰亚胺的小分子化合物，以萘酰亚胺为荧光母体，其4位进行胺基修饰，萘酰亚胺母体上的氮原子与游离的氨基化合物共价连接；其结构式为：分子通式为：[R1R2N-C12NO2-R3-NH2]；式中，R1，R2,R3为含1-8个碳的烷基链、卤素取代的烷基链或者醚氧链。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：易涛，曹春艳，魏鹏，李想，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31