一组氨基酸标志物在急性肾损伤诊断试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及疾病诊断试剂盒领域，具体是一组氨基酸标志物在制备急性肾损伤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述的氨基酸标志物选自犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上。本发明专利技术提出的3个氨基酸标志物能够在急性肾损伤早期准确诊断疾病的发生，单独用于诊断急性肾损伤时AUC值均大于0.7，诊断区分效果较好。其中犬尿氨酸和马尿酸诊断能力优于临床常用肾功能标志物肌酐以及早期诊断标志物NGAL，上述3个氨基酸对AKI的诊断时间均早于临床肾功能标志物尿素氮。本发明专利技术提供的靶向氨基酸代谢组学检测方法能够同时实现多个氨基酸的定量分析，灵敏度高，结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一组氨基酸标志物在急性肾损伤诊断试剂盒中的应用
本专利技术涉及疾病诊断试剂盒领域，具体地说，是三种氨基酸标志物在急性肾损伤诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
急性肾损伤(AKI)是肾脏结构和功能受损的一种疾病状态，以突发和持续的肾功能下降为特征，是由不同病因导致的、涉及全身各系统症状的临床综合征。轻度的肾损伤可以在一段时间后自行恢复，即便AKI患者得到明显缓解，其长期心血管风险仍会增加。重度AKI患者损伤进展至肾衰竭时必须接受透析治疗。2013年我国约有290万住院患者罹患AKI，死亡率约24％。AKI的发生增加了住院患者医疗费用和死亡率，同时造成医疗资源的浪费。改善全球肾脏病预后组织2012制定的临床实践指南(KDIGO指南)中以血肌酐和尿量为标准，将AKI定义为以下任一情况的发生，SCr48小时内升高达≥0.3mg/dL(26.5μmol/L)；或Scr在7天内升高达基础值的≥1.5倍；或尿量＜0.5mL/kg/h持续6小时。肾小球滤过率的快速下降能够通过SCr升高和尿量减少反应，其诊断效果已得到广泛验证。然而，血肌酐水平变化较为迟缓，尿量对肾小球滤过率的评估受血容量影响较大，基于血肌酐和尿量的变化很难做到早期发现和准确评价肾损伤。研究表明急性肾损伤后肾脏的损伤是可以逆转的，早期的AKI诊断能够准确发现AKI患者使其得到及时的干预治疗，降低肾脏的损伤程度。发掘新的AKI早期预警标志物有助于解决目前AKI的诊断不足，使病人在疾病早期就能够被发现。随着基因组学、蛋白组学和代谢组学的发展，AKI早期诊断标志物的发掘研究不断深入。目前发现的AKI早期预警标志物多为肾小管损伤时表达和分泌的特定蛋白，其中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)报道较多，在实验动物和临床病人中均表现出较好的诊断作用且时间早于传统标志物肌酐，但其检测方法较肌酐等小分子标志物更为复杂，多采用酶联免疫法进行检测。该方法灵敏度和特异性较高，但操作过程繁琐检测时间长，且基质中的代谢物可能与抗体出现交叉反应干扰测定结果。肾脏参与体内多种氨基酸的代谢与排泄过程，体内氨基酸水平受到肾脏功能的调节，肾脏功能受到损伤时常发生氨基酸代谢紊乱。近年来研究发现，多种氨基酸水平与肾脏疾病患者的肾功能和预后显著相关，如非对称二甲基精氨酸、对称二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸等。由此可见，完整的肾功能在维持氨基酸循环水平中发挥重要作用，氨基酸作为代谢链终端的小分子代谢物可能成为AKI早期诊断的一个新的目标群体。应用靶向氨基酸代谢组学技术发掘有效的氨基酸标志物对于临床早期快速诊断急性肾损伤具有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一目的在于提供3个可以用于诊断急性肾损伤的氨基酸标志物；本专利技术的第二目的在于提供一种能够同时定量所述氨基酸标志物的分析方法。上述目的是通过以下技术方案得以实现：一组用于诊断急性肾损伤的的血浆氨基酸标志物，包括犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸。一种定量分析所述氨基酸标志物的方法，通过高效液相色谱串联质谱技术对所述氨基酸标志物进行定量分析，该方法具有高通量和高灵敏度的特点能够满足生物样本中代谢物的定量检测。本专利技术的第一方面，提供一组用于诊断急性肾损伤的血浆氨基酸标志物，包括犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸。本专利技术的第二方面，提供一组氨基酸标志物在制备急性肾损伤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述的氨基酸标志物选自犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上。优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为血清学诊断试剂或诊断试剂盒。优选的，所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上的含量。优选的，所述的诊断试剂或试剂盒为采用高效液相色谱串联质谱技术检测血清中犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上含量的试剂的组合。本专利技术的第三方面，提供一种急性肾损伤诊断试剂或试剂盒，所述的诊断试剂或试剂盒中包括检测血清中犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上含量的试剂。本专利技术的第四方面，提供检测血清中犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上含量的试剂在制备急性肾损伤诊断试剂盒中的应用。优选的，所述的试剂为采用高效液相色谱串联质谱技术检测血清中犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上含量的试剂。本专利技术优点在于：本专利技术提供的氨基酸标志物能够在急性肾损伤早期准确诊断疾病，各标志物的诊断价值以ROC曲线分析进行评价，理论上ROC曲线下面积AUC值在0.5到1之间，其值越接近1诊断价值越大，AUC值在0.7到0.9之间表示结果具有临床意义。本专利技术提出的3个氨基酸标志物能够在急性肾损伤早期准确诊断疾病的发生，单独用于诊断急性肾损伤时AUC值均大于0.7，诊断区分效果较好。其中犬尿氨酸和马尿酸诊断能力优于临床常用肾功能标志物肌酐以及早期诊断标志物NGAL，上述3个氨基酸对AKI的诊断时间均早于临床肾功能标志物尿素氮。本专利技术提供的靶向氨基酸代谢组学检测方法能够同时实现多个氨基酸的定量分析，灵敏度高，结果准确可靠。附图说明图1.大鼠血清肌酐，尿素氮和NGAL浓度-时间曲线；图2.大鼠血清差异氨基酸浓度-时间变化曲线。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。使用的仪器或试剂未做详细说明的均为常规仪器或试剂；未具体描述的试验操作方法均为本领域普通技术人员公知的常规操作方法。实施例1：肾脏缺血再灌注大鼠与假手术大鼠血清差异性氨基酸的筛选一、对象与方法1.动物模型制备及分组雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重180-200g，由第二军医大学实验动物中心提供。大鼠饲养一周后进行实验以适应环境，动物房室温约25℃，相对湿度约60％，饲养期间大鼠饮食饮水自由，保持昼夜各12小时的明暗，实验前8小时大鼠禁食不禁水。动物随机分为对照组和AKI组，每组30只，分别在再灌注后0、2、4、6、10、24h经眼眶后静脉丛采血，常温凝血后分离血清样本。AKI组大鼠以10％水合氯醛0.35mL/100g体重腹腔注射麻醉，常规开腹，依次暴露出双侧肾脏，动脉夹夹闭双侧肾动脉，缺血50min后松开动脉夹肾脏恢复灌注，逐层缝合。对照组大鼠按上述过程暴露肾脏，不夹闭肾动脉，50min后缝合腹腔。2.主要试剂肌氨酸氧化酶法肌酐测定试剂盒(南京建成，货号C011-2)，脲酶法尿素氮测定试剂盒(南京建成，货号C013-2)，大鼠NGAL检测Elisa试剂盒(武汉博士德，货号EK0855)，磷酸盐缓冲液(PBS；上海英骏生物)，牛血清白蛋白(BSA；上海博光生物公司)，七氟丁酸(HFBA；Adamas，瑞士)，甲酸(FA；美国天地公司)；马尿酸(Hip)，犬尿氨酸(Kyn)，对称二甲基精氨酸(SDMA)，氧脯氨酸(Oxo)，谷氨酰胺(Gln)，氨基丙二酸(AMA)等6种氨基酸标准品购自大连美仑生物科技公司；其余17种氨基酸标准品购自中国药品生物制品鉴定所(产品批号140624-200805)，包括赖氨酸(Lys)，色氨酸(Trp)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Iso)，苯丙氨酸(Phe)，甲硫氨酸(Met)，苏氨酸(Thr)，缬氨酸(Val)，甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，丝氨酸(Ser)，门冬氨酸(Asp)，酪氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组氨基酸标志物在制备急性肾损伤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述的氨基酸标志物选自犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上。

【技术特征摘要】
1.一组氨基酸标志物在制备急性肾损伤诊断试剂或试剂盒中的应用，所述的氨基酸标志物选自犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上。2.根据权利要求1所述的一组氨基酸标志物在制备急性肾损伤诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒为血清学诊断试剂或诊断试剂盒。3.根据权利要求1所述的一组氨基酸标志物在制备急性肾损伤诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中犬尿氨酸，马尿酸和氧脯氨酸中的一种或两种以上的含量。4.根据权利要求1所述的一组氨基酸标志物在制备急性肾损伤诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒为采用高效...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤，陶霞，陈万生，朱桑，夏天一，翟健秀，龚晓斌，高守红，王清华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：上海,31