一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法。该方法包括野生千层塔孢子体表面灭菌、制备外植体、外植体适应性培养、外植体内生菌灭菌、丛生苗诱导增殖培养、丛生苗生长培养等操作步骤。本发明专利技术无菌外植体丛生苗诱导增殖成功率在90％以上，丛生苗平均繁殖系数可以达到60以上，培养获得的无菌丛生苗可以直接用于制备无菌外植体，进行丛生苗的循环诱导增殖。本发明专利技术不仅提高了千层塔丛生苗的诱导增殖成功率和丛生苗繁殖系数，而且一次灭菌处理就可获得大量无菌外植体，无需重复灭菌操作，降低染菌风险，提高工作效率，简化工艺流程，适用于千层塔的规模化生产。

A Method for Improving the Propagation Coefficient of Cluster Seedlings of Millennium Layer Tower

The invention relates to a method for improving the reproductive coefficient of cluster seedlings of a thousand-layer tower. The method includes sterilization of sporophyte surface, preparation of explants, adaptive culture of explants, sterilization in explants, induction and multiplication of cluster seedlings, and growth and culture of cluster seedlings. The success rate of induced multiplication of aseptic explant cluster seedlings is over 90%, the average reproductive coefficient of cluster seedlings can reach over 60, and the cultured aseptic cluster seedlings can be directly used to prepare aseptic explants for cyclic induced multiplication of cluster seedlings. The invention not only improves the success rate of induced multiplication and the multiplication coefficient of cluster seedlings, but also obtains a large number of aseptic explants by one sterilization treatment without repeated sterilization operation, reduces the risk of infection, improves the work efficiency, simplifies the process flow, and is suitable for large-scale production of the thousand-layer tower.

【技术实现步骤摘要】
一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法。技术背景千层塔，学名蛇足石杉，是一种石杉科石杉属多年生蕨类植物，自然状态下千层塔可以通过孢子繁殖、芽胞繁殖和根部分株繁殖三种方式繁殖，石杉碱甲是千层塔的主要活性成分之一。石杉碱甲是一种可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，能提高大脑中乙酰胆碱的含量，对老年痴呆症具有良好的治疗效果，虽然石杉碱甲的人工合成已经取得一些成果，但是整个合成过程步骤繁琐，成本高，效率低，难以实现工业化生产，因此目前石杉碱甲的主要来源还是从千层塔中提取。虽然千层塔野生资源在不同地区均有分布，但大多生长在环境郁闭度高、年均降雨量多、空气相对湿度大的山地密林中，繁殖缓慢，生产周期长，从萌发到长成完整植株通常需要6～10年。随着人口老龄化的加剧，老年痴呆症频发，石杉碱甲的需求量迅速增长，导致千层塔野生资源遭到过度开采，千层塔植物资源的再生受到了极大限制，因此开发千层塔组织培养技术势在必行。植物组织培养过程受到光照、温度、湿度等诸多环境因子的调控，其中光对植物的生长和分化有着极其重要的作用，影响植物组织培养的整个过程，传统组织培养光源主要是白色光，光调控组织培养植物生长发育的研究大多集中在光强和光照时间，而光质对植物组织培养影响的研究较少。不同光质对不同植物组织培养的作用不同，原因可能是植物体内光敏色素分子的生色团和脱辅基蛋白存在多样性，使光敏色素在植物中存在不同的活性状态，导致不同组织培养植物在诱导增殖方面对光质表现出不同的反应。在植物组织培养中应用较多的单色光是红光和蓝光，红光可增加细胞干物重，有利于根的形成，蓝光可以使植物细胞中的质体转化为叶绿体，对组织培养植物丛生苗诱导增殖有明显的促进作用。L-丝氨酸在植物体内参与多种重要的细胞代谢，在植物组织培养中添加外源L-丝氨酸能促进组织培养植物丛生芽的分化，而且L-丝氨酸还是一种调节植物光呼吸基因表达的信号物质，在培养基中添加L-丝氨酸可以协同促进光诱导增殖作用。千层塔组织培养由于受到繁殖系数低和难以获得大量无菌外植体两方面因素的制约，至今没有实现规模化生产，本专利技术通过结合光质和培养基成分两方面的因素，旨在提供一种适用于规模化生产的千层塔组织培养方法。
技术实现思路
本专利技术以千层塔野生植株本身具有的分株繁殖能力为基础，选取靠近根部的茎段作为外植体，筛选合适的培养基进行组织培养，通过在培养基中添加外源植物激素、外源L-丝氨酸，同时在培养过程中增强蓝色单色光的光照强度，达到提高千层塔外植体丛生苗诱导率和丛生苗繁殖系数的效果，而且通过循环诱导增殖，可以获得大量无菌外植体，实现数量快速放大，为千层塔植物资源的保护与规模化利用提供新途径。一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法具体操作步骤如下：(1)野生千层塔孢子体表面灭菌。选取株高10～15cm的健壮野生千层塔孢子体，在流水中用软毛刷蘸取洗洁精对枝叶和根部进行清洗，冲洗干净表面残留的洗洁精后在超净工作台中依次用75％乙醇溶液浸泡0.5～1.0min、0.1％升汞溶液浸泡5～10min、2％次氯酸钠溶液浸泡15～20min，对孢子体进行表面灭菌处理，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌纸吸干表面水分。(2)制备外植体。在无菌条件下切取孢子体靠近根部、长度为2～3cm、带有6～10片叶子的茎段作为外植体，外植体上部切口为平切口，下部切口为45°角斜切口。(3)外植体适应性培养。将外植体在改良MS培养基中适应性培养2～3周，选取没有染菌、绿色有光泽、叶茎无损伤白斑的外植体，即为表面无菌外植体。其中，改良MS培养基配方为：1/4MS矿质元素+1/2MS有机元素+25g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.8～6.0；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1000～1500Lx，光照时间12～14h。(4)外植体内生菌灭菌。将表面无菌外植体在无菌条件下转接入内生菌灭菌培养基中培养4～5周，选取没有染菌、茎叶有光泽、水分充盈的外植体，即为无菌外植体。其中，内生菌灭菌培养基配方为：改良MS培养基+0.3mg/L孔雀石绿+40mg/L青霉素+50mg/L链霉素+100μg/L两性霉素B；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1500～2000Lx，光照时间12～14h。(5)丛生苗诱导增殖培养。将无菌外植体在无菌条件下转接入丛生苗诱导增殖培养基中进行丛生苗诱导增殖，培养5～6个月后，有90％以上无菌外植体能够成功诱导丛生苗，每个无菌外植体可产生60～70个丛生苗。其中，丛生苗诱导增殖培养基配方为：改良MS培养基+50～150mg/LL-丝氨酸+0.2～0.5mg/L6-BA；培养条件为：温度25±2℃，光照采用白炽灯光+单色蓝光，总光强度为2000～2500Lx(其中，白炽灯光强度1000～1500Lx，波长450～480nm蓝光强度500～1000Lx)，光照时间14～16h。(6)丛生苗生长培养。将诱导的丛生苗在无菌条件下整丛转接入丛生苗生长培养基中培养5～6个月，获得无菌丛生苗，无菌丛生苗高度5～15cm，部分丛下部长有长度0.1～0.5cm的发状根。其中，丛生苗生长培养基为：改良MS培养基+0.1～0.5mg/LNAA；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1500～2000Lx，光照时间12～14h。(7)循环诱导增殖。将培养获得的无菌丛生苗分离为单株，其中一部分单株按照步骤(2)的方法制备无菌外植体，继续步骤(5)、(6)、(7)的操作，进行丛生苗的循环诱导增殖，另一部分单株进行诱导生根培养，长成完整的千层塔无菌植株。步骤(4)中所述的孔雀石绿、青霉素、链霉素、两性霉素B溶液现配现用，均过滤除菌后添加。步骤(5)中所述的蓝光光源为单色蓝光LED灯。步骤(3)、(4)、(5)、(6)中所述的接种量均为60～80mL培养基中接种6～8棵，接种方向与植株自然生长方向相同，直立培养。本专利技术的有益技术效果体现在以下几个方面(1)蓝色光和L-丝氨酸对植物组织培养诱导增殖均具有促进作用，而且L-丝氨酸是一种植物光呼吸调节物质，蓝色光和L-丝氨酸协同作用能够进一步提高对千层塔无菌外植体丛生苗诱导增殖的促进作用。本专利技术通过在培养基中添加外源L-丝氨酸，同时增强蓝色光的光照强度，实现了千层塔无菌外植体丛生苗诱导成功率在90％以上，平均繁殖系数达到60以上，即一个千层塔无菌外植体可以诱导产生60个以上的无菌丛生苗，与自然条件下相比，繁殖系数显著提高。(2)千层塔是伴有内源真菌的蕨类植物，野生千层塔孢子体不仅要进行表面杀菌，而且要杀灭内生菌才能实现无菌培养，灭菌强度过大容易对组织造成伤害，过小则达不到灭菌效果，如何提高灭菌成功率，获得大量灭菌彻底且生长不受影响的无菌外植体是实现千层塔规模化生产的主要制约因素之一。本专利技术只需要进行一次灭菌操作，经过诱导增殖培养获得无菌丛生苗，以无菌丛生苗直接制备无菌外植体，经过循环诱导增殖，可以获得大量无菌外植体，无需重复灭菌操作，提高工作效率，简化工艺流程，满足规模化生产要求。附图说明图1为本专利技术一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法工艺流程。具体实施方式下面结合具体的实施例，对本专利技术做进一步说明。本专利技术的特点和优点将随着描述而更清楚，但这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)野生千层塔孢子体表面灭菌。选取株高10～15cm的健壮野生千层塔孢子体，在流水中用软毛刷蘸取洗洁精对枝叶和根部进行清洗，冲洗干净表面残留的洗洁精后在超净工作台中依次用75％乙醇溶液浸泡0.5～1.0min、0.1％升汞溶液浸泡5～10min、2％次氯酸钠溶液浸泡15～20min，对孢子体进行表面灭菌处理，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌纸吸干表面水分。(2)制备外植体。在无菌条件下切取孢子体靠近根部、长度为2～3cm、带有6～10片叶子的茎段作为外植体，外植体上部切口为平切口，下部切口为45°角斜切口。(3)外植体适应性培养。将外植体在改良MS培养基中适应性培养2～3周，选取没有染菌、绿色有光泽、叶茎无损伤白斑的外植体，即为表面无菌外植体。其中，改良MS培养基配方为：1/4MS矿质元素+1/2MS有机元素+25g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.8～6.0；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1000～1500Lx，光照时间12～14h。(4)外植体内生菌灭菌。将表面无菌外植体在无菌条件下转接入内生菌灭菌培养基中培养4～5周，选取没有染菌、茎叶有光泽、水分充盈的外植体，即为无菌外植体。其中，内生菌灭菌培养基配方为：改良MS培养基+0.3mg/L孔雀石绿+40mg/L青霉素+50mg/L链霉素+100μg/L两性霉素B；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1500～2000Lx，光照时间12～14h。(5)丛生苗诱导增殖培养。将无菌外植体在无菌条件下转接入丛生苗诱导增殖培养基中进行丛生苗诱导增殖，培养5～6个月后，有90％以上无菌外植体能够成功诱导丛生苗，每个无菌外植体可产生60～70个丛生苗。其中，丛生苗诱导增殖培养基配方为：改良MS培养基+50～150mg/LL‑丝氨酸+0.2～0.5mg/L6‑BA；培养条件为：温度25±2℃，光照采用白炽灯光+单色蓝光，总光强度为2000～2500Lx(其中，白炽灯光强度1000～1500Lx，波长450～480nm蓝光强度500～1000Lx)，光照时间14～16h。(6)丛生苗生长培养。将诱导的丛生苗在无菌条件下整丛转接入丛生苗生长培养基中培养5～6个月，获得无菌丛生苗，无菌丛生苗高度5～15cm，部分丛下部长有长度0.1～0.5cm的发状根。其中，丛生苗生长培养基为：改良MS培养基+0.1～0.5mg/LNAA；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1500～2000Lx，光照时间12～14h。(7)循环诱导增殖。将培养获得的无菌丛生苗分离为单株，其中一部分单株按照步骤(2)的方法制备无菌外植体，继续步骤(5)、(6)、(7)的操作，进行丛生苗的循环诱导增殖，另一部分单株进行诱导生根培养，长成完整的千层塔无菌植株。...

【技术特征摘要】
1.一种提高千层塔丛生苗繁殖系数的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)野生千层塔孢子体表面灭菌。选取株高10～15cm的健壮野生千层塔孢子体，在流水中用软毛刷蘸取洗洁精对枝叶和根部进行清洗，冲洗干净表面残留的洗洁精后在超净工作台中依次用75％乙醇溶液浸泡0.5～1.0min、0.1％升汞溶液浸泡5～10min、2％次氯酸钠溶液浸泡15～20min，对孢子体进行表面灭菌处理，最后用无菌水冲洗3～5次，用无菌纸吸干表面水分。(2)制备外植体。在无菌条件下切取孢子体靠近根部、长度为2～3cm、带有6～10片叶子的茎段作为外植体，外植体上部切口为平切口，下部切口为45°角斜切口。(3)外植体适应性培养。将外植体在改良MS培养基中适应性培养2～3周，选取没有染菌、绿色有光泽、叶茎无损伤白斑的外植体，即为表面无菌外植体。其中，改良MS培养基配方为：1/4MS矿质元素+1/2MS有机元素+25g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.8～6.0；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1000～1500Lx，光照时间12～14h。(4)外植体内生菌灭菌。将表面无菌外植体在无菌条件下转接入内生菌灭菌培养基中培养4～5周，选取没有染菌、茎叶有光泽、水分充盈的外植体，即为无菌外植体。其中，内生菌灭菌培养基配方为：改良MS培养基+0.3mg/L孔雀石绿+40mg/L青霉素+50mg/L链霉素+100μg/L两性霉素B；培养条件为：温度25±2℃，白炽灯光强度1500～2000Lx，光照时间12～14h。(5)丛生苗诱导增殖培养。将无菌外植体在无菌条件下转接入丛生苗诱导增殖培养基中进行丛生苗诱导增殖，培养5～6个月后，有90％以上无...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宏伟，
申请(专利权)人：合肥本盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34