一种茶树鲜叶茸毛的提取方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种快速提取茶树鲜叶茸毛的方法及其应用，具体步骤如下：（1）取带茸毛的茶树芽或叶片等鲜嫩组织，自然放入50ml离心管，在液氮中快速冷冻；（2）手握冷冻后的离心管样品在旋涡混合器上连续振动20s~30s，使样品表面的茸毛摩擦脱落并附着在管壁和管底上；（3）用液氮冷冻过的药匙迅速将附着于管壁和管底上的茸毛刮下，放入液氮冷冻的离心管中保存，重复数次，直至收集到所需量的茸毛。本方法提取出的茸毛样品，最大程度上保持了样品的新鲜，提取出的茸毛能够用于RNA提取，可以用于分子生物学研究和代谢物分析，为茶树茸毛的研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种茶树鲜叶茸毛的提取方法及其应用
本专利技术涉及一种茶树鲜叶组织茸毛的提取方法及其应用。
技术介绍
茶树（Camelliasinensis(L.)O.Kuntze）是我国一种重要的多年生常绿经济作物，其幼嫩芽叶经不同加工工艺可以制成不同茶类。茸毛是茶树幼嫩芽叶组织特有的物质。通常茸毛越多的茶叶其加工的原料更加幼嫩，茸毛中也含有一定量的茶氨酸、茶多酚、咖啡碱等茶叶特异成分，同时也含有丰富的微量元素和挥发性物质（宋亚康等，2017；叶乃兴等，2010；尹鹏等，2018），因此，茸毛的有无及多少与茶叶的品质密切相关。目前对茶树茸毛的研究主要集中在生化成分测定上，且所测定的茸毛主要是从成品茶中经研磨和分筛后提取出来的，这种茸毛不仅经过了长时间的加工和研磨处理，还混有部分茶叶粉末，严重干扰了茶树中茸毛物质的组成及含量测定。同时，这样从成品茶中提取出的茸毛也不可以用于从分子生物学水分研究茶树茸毛。要准确测定茶树茸毛的生化成分及开展茸毛的分子生物学研究，首先必须能够从鲜叶上提取新鲜的茸毛，并保证茸毛始终在低温条件下，避免物质转化及RNA等的降解。但至今没有一种理想的方法用于提取茶树鲜叶中的茸毛。所以，如何提供一种能够在低温条件下快速提取茶树鲜叶茸毛的方法是开展茶树茸毛研究急需解决的关键难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在低温条件下快速提取茶树鲜叶茸毛的方法，为茶树茸毛物质代谢和分子生物学研究奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：要求：提取中所用的离心管、药匙都需液氮冷冻，并维持在低温状态；样品要求有茸毛的单芽、一芽一叶、一芽二叶和一芽三叶茶树鲜叶样品；样品装入冷冻的离心管，在离心管中的体积不超过离心管体积的2/3；握住样品在旋涡混合器上振动，振动频率在1200~2800r/min，每次液氮冷冻后提取时间不超过30s，如一次未将茸毛脱落净，可用液氮冷冻处理后重复提取。一种茶树鲜叶茸毛的提取方法，具体包括如下步骤：（1）取单芽、一芽一叶、一芽二叶和一芽三叶的茶树鲜叶，取下含茸毛的叶片和芽组织，自然舒展装入50ml离心管中，样品体积不超过离心管体积的2/3，拧紧离心管盖子，放入液氮中快速冷冻50s~150s；（2）迅速从液氮中取出步骤（1）的装样品的离心管，用手握住置于旋涡混合器上连续振动20s~30s，通过振动作用将茸毛抖动脱落，脱落后的茸毛将黏于管壁和管底上；（3）另取一个离心管放入液氮中冷冻，快速拧开步骤（2）的离心管盖子，用液氮冷冻过的药匙迅速刮下黏在管壁上的茸毛，将茸毛转入液氮冷冻着的离心管中，倒掉提取过的样品，再用药匙将管底的茸毛取出，迅速放入装茸毛的冷冻离心管中；（4）重复步骤（1）-（3）多次，提取获得所需量的茸毛，茸毛样品放入-80℃超低温冰箱保存备用。步骤（2）中旋涡混合器的振动频率1200~2800r/min。其中，步骤（1）中的样品体积不超过离心管体积的2/3，样品需液氮冷冻完全后（50s~150s）再进行振动；步骤（2）中，振动时需保持离心管处于低温状态，因此需要短时快速振动，振动频率1200~2800r/min，每次冷冻样品振动时间不超过30s；提取过程中所用的离心管、药匙等均应用液氮冷冻，保持低温状态。茶树茸毛在提取茶树茸毛总RNA中的应用，具体操作如下：将提取的茸毛样品置于液氮中研磨成粉末，取出100mg粉末，用离心柱型植物总RNA提取试剂盒提取茸毛中的总RNA。本专利技术的显著优点：本方法提取出的茸毛样品，最大程度上保持了样品的新鲜，提取出的茸毛能够用于RNA提取，可以用于分子生物学研究和代谢物分析，为茶树茸毛的研究奠定基础。附图说明图1为新鲜茶树样品提取的茸毛；其中，1：未提取茸毛的茶树新鲜组织样品；2：提取过茸毛的茶树新鲜组织样品；3：提取的新鲜茶树茸毛；图2为RNA电泳图；其中，M：DL5000；1：未提取茸毛的茶树组织样品提取的总RNA；2：提取过茸毛的茶树组织样品提取的总RNA；3：茸毛提取的总RNA。具体实施方式通过下述实施例将有助于理解本专利技术，但并不限制本专利技术的内容。实施例1一、一种茶树鲜叶茸毛的提取方法，具体包括如下步骤：（1）取单芽、一芽一叶、一芽二叶和一芽三叶的茶树鲜叶，取下含茸毛的叶片和芽组织，自然舒展装入50ml离心管中，样品体积不超过离心管体积的2/3，拧紧离心管盖子，放入液氮中快速冷冻50s；（2）迅速从液氮中取出步骤（1）的装样品的离心管，用手握住置于旋涡混合器上连续振动20s，通过振动作用将茸毛抖动脱落，脱落后的茸毛将黏于管壁和管底上；（3）另取一个离心管放入液氮中冷冻，快速拧开步骤（2）的离心管盖子，用液氮冷冻过的药匙迅速刮下黏在管壁上的茸毛（如图1所示），将茸毛转入液氮冷冻着的离心管中，倒掉提取过的样品，再用药匙将管底的茸毛取出，迅速放入装茸毛的冷冻离心管中；（4）重复步骤（1）-（3）多次，提取获得所需量的茸毛，茸毛样品放入-80℃超低温冰箱保存备用。步骤（2）中旋涡混合器的振动频率1500r/min。二、茶树茸毛总RNA提取将提取的茸毛样品置于液氮中研磨成粉末；取出100mg粉末，用离心柱型植物总RNA提取试剂盒，按照说明书操作提取茸毛中的总RNA。三、茶树茸毛总RNA质量检测1、完整性检测：利用普通琼脂糖凝胶电泳对总RNA的完整性进行检测，电泳条件：胶浓度为1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；100V，20min。电泳结束后在紫外光凝胶成像系统上观察，并保存图像，如图2所示。从图2可以看出：同叶片中的RNA一样，茸毛RNA条带清晰，完整性好，无降解。说明本专利技术提取的茸毛材料可以用于茸毛的RNA提取，反映出提取的茸毛新鲜，能够满足后续对茸毛的深入研究。2、纯度和浓度检测：取1μL提取的RNA，在NanoDrop2000C超微量分光光度计上测定分析，获得表1数据。表1RNA浓度和纯度测定结果从表1中可以看出，通过本专利技术提取的茸毛样品，其提取出的RNA纯度高、污染少，相同质量的样品中提取出的RNA浓度与叶片中提取的RNA浓度接近。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡依本专利技术申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本专利技术的涵盖范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茶树鲜叶茸毛的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）取单芽、一芽一叶、一芽二叶和一芽三叶的茶树鲜叶，取下含茸毛的叶片和芽组织，自然舒展装入50ml离心管中，样品体积不超过离心管体积的2/3，拧紧离心管盖子，放入液氮中快速冷冻50s~150s；（2）迅速从液氮中取出步骤（1）的装样品的离心管，用手握住置于旋涡混合器上连续振动20s~30s，通过振动作用将茸毛抖动脱落，脱落后的茸毛将黏于管壁和管底上；（3）另取一个离心管放入液氮中冷冻，快速拧开步骤（2）的离心管盖子，用液氮冷冻过的药匙迅速刮下黏在管壁上的茸毛，将茸毛转入液氮冷冻着的离心管中，倒掉提取过的样品，再用药匙将管底的茸毛取出，迅速放入装茸毛的冷冻离心管中；（4）将提取到的茸毛样品放入‑80℃超低温冰箱保存。

【技术特征摘要】
1.一种茶树鲜叶茸毛的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）取单芽、一芽一叶、一芽二叶和一芽三叶的茶树鲜叶，取下含茸毛的叶片和芽组织，自然舒展装入50ml离心管中，样品体积不超过离心管体积的2/3，拧紧离心管盖子，放入液氮中快速冷冻50s~150s；（2）迅速从液氮中取出步骤（1）的装样品的离心管，用手握住置于旋涡混合器上连续振动20s~30s，通过振动作用将茸毛抖动脱落，脱落后的茸毛将黏于管壁和管底上；（3）另取一个离心管放入液氮中冷冻，快速拧开步骤（2）的离心管盖子，用液氮冷冻过的药匙迅速刮下黏在管壁上的茸毛，将茸毛转入液氮冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳川，曹红利，孙云，林宏政，叶乃兴，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35