一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，具体步骤如下:获取紫苏无菌苗；取无菌苗外植体诱导质地优良的愈伤组织；以紫苏愈伤组织为原材料，采用Box‑Behnken中心组合设计和响应面法对液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳条件进行优化；紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证。发明专利技术方法的迷迭香酸产量提高近10倍，同时更快速地获取高产迷迭香酸的愈伤组织，节约成本、节约室内培养空间、可以周年生产、培养效益明显增加，不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考；具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法
本专利技术属于植物细胞培养生产次生代谢产物的
，具体为一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法。
技术介绍
紫苏(Perillafrutescens(L.)Britt.)，别名荏、白苏、赤苏等，为唇形科一年生草本植物，原产于中国，主要分布于中国、印度、日本、韩国等国家，是我国卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药材之一。紫苏叶中含有多种具有生理活性的天然化学成分，如花青素、木犀草素、芹菜素、儿茶素、迷迭香酸(RosmarinicAcid,RosA)等，其中迷迭香酸含量较高。迷迭香酸是一种天然的水溶性抗氧化剂，具有多种生物活性，具有明显的抗炎、抗氧化、免疫抑制等作用，广泛应用于食品、医药和化妆品领。因此迷迭香酸的生产越来越受到人们的广泛关注，如何有效提高植物中迷迭香酸的含量也成为当今研究的热门话题之一。植物细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化，具有细胞分散性好，形状及大小一致、生产迅速、易于控制等优势，已被广泛应用于生理生化、分子生物学等基础研究以及育种、次生代谢物生产等领域。自从1956年，Routine和Nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来，据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。紫苏细胞悬浮培养生产次生代谢物质如花青素、三萜类化合物等已有报道，但关于细胞悬浮培养生产迷迭香酸研究报道少且产量较低。本研究旨在通过响应面法优化紫苏细胞悬浮培养生产迷迭香酸的条件，为紫苏细胞大规模培养次生代谢产物提供理论依据和技术参考。
技术实现思路
本专利技术为解决天然的植物次生代谢产物迷迭香酸产量较低，而化学合成迷迭香酸非绿色，成本高的问题，提供了一种紫苏细胞悬浮生产高产迷迭香酸的方法，本方法不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考。为实现上述目的本专利技术采用以下技术方案：一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)紫苏无菌苗的获得将紫苏种子进行清洗灭菌，除去毒性较高的HgCl2，将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基的组培瓶中萌发，一定温度光照下，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体；(2)愈伤组织的诱导在无菌条件下，将生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切段，子叶切块，接种于含植物激素组合的诱导培养基上，下胚轴横放于培养基上，轻按使切口两端充分接触培养基，子叶平铺于培养基表面；(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系；将诱导培养基上生长旺盛，表面干燥，质地松散的浅黄色愈伤组织转到B5液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养，如此反复在B5液体培养基连续继代3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系；(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比采用Box-Behnken试验设计方案，选择苯丙氨酸浓度，酪氨酸浓度、酵母提取物浓度以及激素类似物CPPU浓度为考察变量，以迷迭香酸含量为响应值设计中心组合试验；试验处理共29组，每组重复三次。最终建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸、酵母提取物以及CPPU添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用DesignExpert8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案；(5)细胞干重及迷迭香酸含量测定将悬浮细胞倒在尼龙网上，真空抽滤，60℃烘12h后称干重，每个处理重复三次，准确称取待测愈伤组织粉末0.1g，加入2mL60％乙醇溶液，超声波60℃提取20min，离心，获得提取液，60％乙醇定容至2mL，采用FeSO4显色法测定悬浮培养物中迷迭香酸含量；(6)紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证使用DesignExpert8.0软件确定紫苏细胞悬浮培养的最佳方案，再根据上述条件做验证实验，以充分验证所建模型的有效性，说明回归方程能否较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。作为本专利技术进一步的方案：将紫苏种子用自来水冲洗两次后先经70％(V/V)乙醇消毒30s，用无菌水洗涤3次，接着分别在0.1％升汞溶液中浸泡l0min，然后用无菌水洗涤3-5次，每次不少于5min，以彻底除去毒性较高的HgCl2。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(1)中，中紫苏种子为9月中下旬收获的自然成熟种子，棕褐色、籽粒饱满，一定温度光照下具体为：在25士1℃下，每日光照16h，13天龄的无菌苗。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(1)中，MS基本培养基中附加3％蔗糖，琼脂，pH5.8，121℃灭菌20min。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(2)中，将11-13日龄的紫苏幼苗下胚轴切成0.5～1cm的小段，子叶切成0.5cm2的小块，接种于含植物激素组合(B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L)的诱导培养基中上，培养室的温度控制在25～28℃，每日光照时间为10～12h，光照强度为1600～2000Lux。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(3)中，液体悬浮培养的基本培养条件为，培养温度25～28℃，培养时间8-15d，pH值为8，接种密度30g/L，蔗糖浓度30g/L，摇床转速120r/min。本专利技术在确定了悬浮培养基本条件的基础上，从细胞水平和基因水平入手，以诱导迷迭香酸积累的重要前提物质(酵母提取物、苯丙氨酸、酪氨酸)和激素类似物CPPU为优化变量，采用Box-Behnken中心组合设计和响应面法对最佳培养条件进行优化，并建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸以及酵母提取物添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用DesignExpert8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案。在液体悬浮培养基本条件及优化条件的基础上，做三次平行试验以验证最佳条件，其误差小于0.5％，以表明紫苏液体悬浮培养生产迷迭香酸的预测值与实测值之间具有良好的拟合性，充分验证了所建模型的有效性，说明回归方程能否较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。本专利技术中所用的B5培养基的主要特点是含有较低的铵，相对MS基本培养基而言，较少的铵可以有效降低其对愈伤组织的生长抑制作用，也可以有效防止愈伤组织的褐化现象。特别注意的是在进行液体悬浮培养之前，务必挑选松脆型愈伤组织作为悬浮原料，因为这样的愈伤组织内有大量较大的细胞间隙，细胞排列无次序，容易分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团，是进行悬浮培养的最适宜材料。现有的提取迷迭香酸的方法有植提法和悬浮细胞培养法。植提法只能以大田中已经成熟的植物为材料提取植物体内有限的迷迭香酸，并且在提取的过程中不可避免地运用有机溶剂，该方法的实施不仅严重受到季节的限制，而且有机溶剂的使用对迷迭香酸的进一步应用存在潜在威胁。现有的悬浮细胞培养法虽然解决了材料的季节性限制问题以及有机溶剂的使用问题，但其迷迭香酸的产量并没有得以提高。本专利技术的有益效果是：与现有的生产迷迭香酸的方法相比，本专利技术提供的是一种紫苏细胞悬浮培养生产迷迭香酸的优化方法。本方法在遵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)紫苏无菌苗的获得将紫苏种子进行清洗灭菌，除去毒性较高的HgCl2，将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基的组培瓶中萌发，一定温度光照下，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体；(2)愈伤组织的诱导在无菌条件下，将生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切段，子叶切块，接种于含植物激素组合的诱导培养基上，下胚轴横放于培养基上，轻按使切口两端充分接触培养基，子叶平铺于培养基表面；(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系；将诱导培养基上生长旺盛，表面干燥，质地松散的浅黄色愈伤组织转到B5液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养，如此反复在B5液体培养基连续继代3‑4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系；(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比采用Box‑Behnken试验设计方案，选择苯丙氨酸浓度，酪氨酸浓度、酵母提取物浓度以及激素类似物CPPU浓度为考察变量，以迷迭香酸含量为响应值设计中心组合试验；试验处理共29组，每组重复三次。最终建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸、酵母提取物以及CPPU添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用Design Expert 8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案；(5)细胞干重及迷迭香酸含量测定将悬浮细胞倒在尼龙网上，真空抽滤，60℃烘12h后称干重，每个处理重复三次，准确称取待测愈伤组织粉末0.1g，加入2mL 60％乙醇溶液，超声波60℃提取20min，离心，获得提取液，60％乙醇定容至2mL，采用FeSO4显色法测定悬浮培养物中迷迭香酸含量；(6)紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证使用Design Expert 8.0软件确定紫苏细胞悬浮培养的最佳方案，再根据上述条件做验证实验，以充分验证所建模型的有效性，说明回归方程能否较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。...

【技术特征摘要】
1.一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)紫苏无菌苗的获得将紫苏种子进行清洗灭菌，除去毒性较高的HgCl2，将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基的组培瓶中萌发，一定温度光照下，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体；(2)愈伤组织的诱导在无菌条件下，将生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切段，子叶切块，接种于含植物激素组合的诱导培养基上，下胚轴横放于培养基上，轻按使切口两端充分接触培养基，子叶平铺于培养基表面；(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系；将诱导培养基上生长旺盛，表面干燥，质地松散的浅黄色愈伤组织转到B5液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养，如此反复在B5液体培养基连续继代3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系；(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比采用Box-Behnken试验设计方案，选择苯丙氨酸浓度，酪氨酸浓度、酵母提取物浓度以及激素类似物CPPU浓度为考察变量，以迷迭香酸含量为响应值设计中心组合试验；试验处理共29组，每组重复三次。最终建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸、酵母提取物以及CPPU添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用DesignExpert8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案；(5)细胞干重及迷迭香酸含量测定将悬浮细胞倒在尼龙网上，真空抽滤，60℃烘12h后称干重，每个处理重复三次，准确称取待测愈伤组织粉末0.1g，加入2mL60％乙醇溶液，超声波60℃提取20min，离心，获得提取液，60％乙醇定容至2mL，采用FeSO4显色法测定悬浮培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李会珍，李娜，张志军，
申请(专利权)人：中北大学，山西金紫苏生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山西,14