一种从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体涉及一种从酶解液中高效提取D‑泛解酸的方法。本发明专利技术所述从酶解液中高效提取D‑泛解酸的方法，在现有D‑泛解酸提取方法的基础上，通过对所述萃取溶剂进一步优化，使得以现有乙酸乙酯为萃取剂对酶解液中D‑泛解酸的提取更为彻底，对于本发明专利技术以D‑泛解酸为目标提取物的工艺而言，有效排除了萃取后水相中其他物质的干扰，使得后续的精制处理过程更为简单。

【技术实现步骤摘要】
一种从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法。
技术介绍
泛酸，又称遍多酸、维生素B5，广泛存在于生物界中，是动物体内合成辅酶A的主要原料，其主要作用是参与糖、脂肪和蛋白质的代谢。人体缺乏泛酸会引起肌肉酸痛或痉挛、肾上腺机能不足和减退、注意力不集中、手脚麻木、便秘、精力缺乏、轻微锻炼后即筋疲力尽、忧虑、紧张以及磨牙等症状。泛酸以其特有的生化功能广泛应用于医药、饲料和食品等领域。而D-泛解酸内酯(D-PL)则是合成D-泛酸系列产品最重要的手型中间体。现有技术中通常只能由化学合成的方法制得DL-泛解酸内酯，在进行DL-泛解酸内酯的拆分。DL-泛解酸内酯的拆分方法大都是采用化学方法，其缺点是拆分剂昂贵，成本高，且分离困难。生物拆分方法中，采用微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯，因具有环境污染和毒性少等特点而成为研究的一个重要方向。微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯的一种方式是利用产L-泛解酸内酯酶的微生物，分解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯，得到未分解的D-构型泛解酸内酯；此方法的缺点只有L-构型的内酯被水解得非常彻底才能得到高光学纯度的D-泛解酸内酯，并且反应时间长，而且长时间的水解过程会导致一部分D-泛解酸内酯水解，导致得到的产物D-泛解酸内酯收率不高；另一种方式是利用产D-泛解酸内酯酶的微生物，选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，进而得到D-泛解酸，再将D-泛解酸进行内酯化生成D-泛解酸内酯；该方法水解时间短，虽然水解率不高(30％左右)，但未水解的L-泛解酸内酯可消旋后再利用，产物的总体收率较高，因此，成为现有技术中制备D-泛解酸和D-泛解酸内酯的主流方法。现有技术中已知报道的能产生D-泛解酸内酯水解酶的菌株包括尖镰孢霉菌、串珠镰孢霉菌等，并且通过菌种活化以及产酶条件的优化，使得D-泛解酸的酶解效率有了很大的提高，但是，酶解液中目标产物的高效提取也是D-泛解酸酶解工艺中的一个难题。现有技术中对于D-泛解酸和/或D-泛解酸内酯的提取多以有机溶剂萃取法进行，即以乙酸乙酯为萃取溶剂提取未反应的L-泛解酸内酯和少了D-泛解酸内酯，而酶解的D-泛解酸则进入水相，再将水相中的D-泛解酸进行内酯化制得D-泛解酸内酯。但是，通常情况下，乙酸乙酯对D-泛解酸内酯的一次提取率只有70％左右，因此，常使得少量的D-泛解酸内酯依然残留于水相中。当然，这对于以D-泛解酸内酯为终产物的工艺而言，并没有什么影响，但对于以D-泛解酸为目标终产物的工艺而言，则存在着提取率尤其是一次提取率略低的问题，使得后续还需要进行额外精制处理，并且造成了D-泛解酸内酯的原料浪费。虽然现有技术中通过添加钠盐的方式进一步提高了乙酸乙酯对D-泛解酸内酯的提取率，但是，由于加入的钠盐会存在于水相中，对后续D-泛解酸的精制也造成一定的困扰。再者，以乙酸乙酯为萃取溶剂进行提取过程中，必须先经过加热灭酶的处理过程，以消除D-泛解酸内酯水解酶对乙酸乙酯进行水解产生的负面影响，也使得提取过程更为复杂。因此，如何从酶解液中高效提取D-泛解酸也成为D-泛解酸酶解工艺中亟待解决的问题。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，包括如下步骤：(1)取含D-泛解酸酶解液经固液分离去除菌体，收集上清液，备用；(2)向所得上清液中加入含有疏水性离子液体的有机溶剂萃取，静置分层后，收集水相，即为含D-泛解酸水溶液。所述步骤(2)中，所述疏水性离子液体为疏水性氨基酸离子液体。所述步骤(2)中，所述疏水性氨基酸离子液体包括脯氨酸甲酯六氟磷酸盐。所述步骤(2)中，所述疏水性离子液体与所述有机溶剂的体积比为3-5：100。所述步骤(2)中，所述有机溶剂包括乙酸乙酯。所述步骤(2)中，所述有机溶剂与所述上清液的体积比为1-2：1。所述步骤(1)中，所述固液分离步骤为压滤或离心过滤。所述步骤(1)中，还包括对所述酶解液进行预处理的步骤。所述预处理步骤包括向所述酶解液中加入硅藻土混匀的步骤。所述步骤(2)中，还包括将收集的含D-泛解酸水溶液经浓缩、结晶进行精制的步骤，得到D-泛解酸纯品。本专利技术所述从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，在现有D-泛解酸提取方法的基础上，通过对所述萃取溶剂进一步优化，使得以现有乙酸乙酯为萃取剂对酶解液中D-泛解酸的提取更为彻底，而疏水性离子液体的存在，有效改进了诸如D-泛解酸内酯、DL-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯在有机相中的溶解情况，使得乙酸乙酯的一次提取率大大提高，对于本专利技术以D-泛解酸为目标提取物的工艺而言，有效排除了萃取后水相中其他物质的干扰，使得后续的精制处理过程更为简单；而且，本专利技术所述高效提取D-泛解酸的方法，疏水性离子液体的存在，有效抑制了D-泛解酸内酯水解酶对于乙酸乙酯的水解，使得整个提取方法无需对酶解液进行额外的灭酶处理，简化了提取的过程。具体实施方式实施例1本实施例中提取所述D-泛解酸的酶解液为按照现有技术方法发酵产酶及酶解转化获得，即以野生型镰孢霉菌进行产酶发酵获得含有D-泛解酸内酯水解酶的粗酶液。所述培养基及培养条件可参照江南大学汤一新《微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯》中记载的产酶方法和酶解转化方法。发酵培养基配方为：甘油1％，酵母膏1％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.4％，pH8.0，发酵产酶培养后收集粗酶液。将化学法制备的DL-泛解酸内酯配制成浓度200g/L的水溶液，并加入30mmol/L的Ca2+，于30、℃pH7.0条件下进行粗酶液转化酶解10h，获得酶解液。经检测，所得酶解液中含有D-泛解酸的含量为35.06g/L。本实施例所述从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，包括如下步骤：(1)取上述制得的含D-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；(2)按照1：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比3：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含D-泛解酸水溶液。经检测，所得含D-泛解酸水溶液中，D-泛解酸内酯的含量＜0.05g/L，DL-泛解酸内酯的含量＜0.02g/L，L-泛解酸内酯的含量＜0.02g/L，而所述D-泛解酸的含量＞35g/L。可见，本专利技术所述从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法可有效的促进D-泛解酸与其他物质的一次性萃取分离，并提高了萃取效率。所得含D-泛解酸水溶液经常规浓缩、结晶，即可得到D-泛解酸纯品。实施例2本实施例所述从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，其提取酶解液与实施例1相同。本实施例所述从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，包括如下步骤：(1)取上述制得的含D-泛解酸酶解液，加入2％的硅藻土混匀进行预处理10min，随后经离心去除菌体和硅藻土，收集上清液，备用；(2)按照2：1的体积比向所得上清液中加入含有脯氨酸甲酯六氟磷酸盐的乙酸乙酯(体积比5：100)混合进行萃取，充分混匀后静置分层，随后收集水相，即为含D-泛解酸水溶液。经检测，所得含D-泛解酸水溶液中，D-泛解酸内酯的含量＜0.05g/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从酶解液中高效提取D‑泛解酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取含D‑泛解酸酶解液经固液分离去除菌体，收集上清液，备用；(2)向所得上清液中加入含有疏水性离子液体的有机溶剂萃取，静置分层后，收集水相，即为含D‑泛解酸水溶液。

【技术特征摘要】
1.一种从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取含D-泛解酸酶解液经固液分离去除菌体，收集上清液，备用；(2)向所得上清液中加入含有疏水性离子液体的有机溶剂萃取，静置分层后，收集水相，即为含D-泛解酸水溶液。2.根据权利要求1所述的从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述疏水性离子液体为疏水性氨基酸离子液体。3.根据权利要求2所述的从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述疏水性氨基酸离子液体包括脯氨酸甲酯六氟磷酸盐。4.根据权利要求1-3任一项所述的从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述疏水性离子液体与所述有机溶剂的体积比为3-5：100。5.根据权利要求1-4任一项所述的从酶解液中高效提取D-泛解酸的方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴红光，
申请(专利权)人：成都本则生科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51