一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选及提取方法技术

本发明专利技术是一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选及提取方法。本发明专利技术包括：⑴预处理：取白藤梨根药材烘干后粉碎，过药筛得到颗粒均匀的粉末；⑵制备石油醚提取物：取白藤梨根粉末，量取石油醚浸泡白藤梨根粉末，超声提取后将白藤梨根药渣与提取液分离，提取液过滤浓缩，得到石油醚提取物；⑶制备乙酸乙酯提取物：将步骤⑵中的白藤梨根药渣烘干后置于乙酸乙酯中浸泡，再用乙酸乙酯为溶剂采用渗漉法提取，药渣待用，渗漉液减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物；⑷制备乙醇提取物：将步骤⑶中的白藤梨根药渣烘干，加入乙醇浸泡再用乙醇为溶剂采用渗漉法提取，渗漉液过滤浓缩，得到乙醇提取物；⑸活性评价：体外抗肿瘤实验检测三种提取物对肿瘤细胞活性的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选及提取方法
本专利技术涉及中药材中活性物质筛选与提取
，特别是一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选及提取方法。
技术介绍
随着社会及经济的发展，生产环境及生活方式的改变，恶性肿瘤成为威胁人类健康的主要疾病之一。自20世纪70年代以来中国恶性肿瘤发病率和死亡率呈持续增长趋势，在肝癌、食道，胃、肺等恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。近些年大量临床及实验数据表明中医中药在肿瘤患者的治疗过程中有其独到的作用，已经成为肿瘤综合治疗的重要组成部分。中药在改善肿瘤患者临床症状，提高患者生存质量，防止肿瘤复发转移，以及与化疗配合增效减毒等方面都有很好的疗效。但是，中药所含的化学成分十分复杂，既含有效成分，也有无效成分，日常煎煮服用也不方便。中药提取就是利用一些技术最大限度提取其中有效成份，使得中药制剂的内在质量和临床治疗效果提高，使中药的效果得以最大限度的发挥。提取中药中的有效成分并进一步加以分离、纯化，得到有效单体是当前中药研究领域中的一项重要内容。从中草药中提取出抗肿瘤的有效活性成分，已成为抗肿瘤药物开发的重要来源。毛花猕猴桃(ActinidiaerianthaBenth)，即我们俗称的白藤梨，是猕猴桃科猕猴桃属植物，广泛分布于浙江、福建、江西、广西及广东。白藤梨根是毛花猕猴桃的干燥根，性寒、味苦涩，具有清热、利湿、活血消肿、解毒等功效，为畲族民间治疗肿瘤的习用药材，广泛地用于抗肿瘤的治疗。但是长久以来白藤梨根抗肿瘤的有效活性部位并不明确，导致其有效活性成分的提取也缺乏针对性。现有的提取工艺一般采用水或乙醇为溶剂进行回流提取，得到水提物或醇提物；或者用95％乙醇浸渍提取，提取完后再用75％乙醇浸渍提取，合并提取液，得到乙醇总提取物，再用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等极性不同的溶剂萃取，最后得到不同的有效成分。热提取方法对药材中热不稳定的有效成分来说，容易造成破坏或结构改变，而且水提液或醇提液溶剂回收困难，不易保存或运输。此外，萃取工艺比较繁杂，在萃取过程中不同极性溶剂萃取不够充分，二氯甲烷萃取还易产生乳化等现象，操作费时，不适合工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种白藤梨根中有效活动物质的筛选及提取方法。本专利技术采用的技术方案是通过如下方式完成的：一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法，该白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法包括以下步骤：⑴预处理：取一定量的白藤梨根药材，烘干后高速粉碎机粉碎，过药筛得到颗粒均匀的白藤梨根粉末；⑵制备石油醚提取物：称取适量白藤梨根粉末，量取一定体积的石油醚浸泡白藤梨根粉末，超声提取后将白藤梨根药渣与提取液分离，提取液用滤纸过滤后，用旋转蒸发仪减压浓缩，得到石油醚提取物；⑶制备乙酸乙酯提取物：将步骤⑵中超声提取后的白藤梨根药渣在烘箱中烘干，挥干残余的溶剂，烘干后的药渣置于一定体积的乙酸乙酯中浸泡，浸泡后的白藤梨根药渣用乙酸乙酯为溶剂采用渗漉法提取，药渣待用，渗漉液用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物；⑷制备乙醇提取物：将步骤⑶中渗漉提取后的白藤梨根药渣经烘箱烘干溶剂，加入一定体积的乙醇浸泡，浸泡后的白藤梨根药渣用乙醇为溶剂采用渗漉法提取，渗漉液用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到乙醇提取物；⑸活性评价：采用RTCADP实时细胞分析系统进行体外抗肿瘤实验，检测以上三种提取物对肿瘤细胞活性的影响，根据实验结果筛选出抗肿瘤效果最佳的提取物。在所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法中，所述的三种提取物中乙酸乙酯提取物中所含抗肿瘤活性物质含量最高，对肿瘤细胞抑制作用明显，乙酸乙酯提取物对人肝癌HepG2细胞有显著抑制作用，IC50为7.6μg/mL；对人肺癌A549细胞有抑制作用，IC50为150μg/mL。在所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法中，所述抗肿瘤效果最佳的提取物是乙酸乙酯提取物，其中的活性成分为三萜类化合物。在所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法中，所述步骤⑸中选用的肿瘤细胞为人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞中的至少一种。在所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法中，所述步骤⑸的具体操作为：取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，先在E-Plate板上每孔放入50μL培养基测基线，随后加入100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，记录细胞指数(CI)；设正常对照组、0.2％DMSO对照组、三种提取物试验组，每组设3复孔，培养24h后，在试验组中加入一定浓度的提取物处理细胞，继续培养72h，记录CI值，筛选对肿瘤细胞抑制作用较好的样品进行200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL6个浓度的CI值检测，计算IC50。一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的提取方法，该白藤梨根抗肿瘤活性物质的提取方法包括以下步骤：⑴预处理：取一定量的白藤梨根药材，烘干后高速粉碎机粉碎，过药筛得到颗粒均匀的白藤梨根粉末；⑵石油醚分离：称取适量白藤梨根粉末，量取一定体积的石油醚浸泡白藤梨根粉末，超声提取后将白藤梨根药渣与石油醚提取液分离，将白藤梨根中所含极性很小的成分分离开，以便提高后续提取纯度；⑶制备乙酸乙酯提取物：将步骤⑵中超声提取后的白藤梨根药渣在烘箱中烘干，挥干残余的溶剂，烘干后的药渣置于一定体积的乙酸乙酯中浸泡，浸泡后的白藤梨根药渣用乙酸乙酯为溶剂采用渗漉法提取，渗漉液用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物；在所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的提取方法中，所述步骤⑵具体操作为：称取白藤梨根粉末10g～1000g，加入5倍量(溶剂体积与药材重量比)的石油醚浸泡30min后，超声提取2次，每次30min，合并提取液，分离出白藤梨根药渣。在所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的提取方法中，所述步骤⑶具体操作为：将步骤⑵中的白藤梨根药渣经烘箱65℃烘干，挥干溶剂，加入5倍量(溶剂体积与药材重量比)的乙酸乙酯浸泡12h，用10倍量(溶剂体积与药材重量比)的乙酸乙酯渗漉提取，渗漉速度为2ml/min，收集渗漉液，合并后滤纸过滤，旋转蒸发仪中减压浓缩，减压浓缩的条件为压力150mbar，温度39℃，回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物，得率为0.72％～1.08％。采用紫外分光光度法对白藤梨根抗肿瘤的有效活性部位中总三萜的含量进行测定，以熊果酸为标准品，5％香草醛-冰乙酸及高氯酸进行显色，在550nm处测得吸光度，代入熊果酸的标准曲线测得其总三萜含量。本专利技术中在筛选白藤梨根中抗肿瘤活性物质时，按溶剂极性从小到大提取白藤梨根中的成分，采用石油醚超声提取，高效快速地提取出白藤梨根的小极性成分；再依次用乙酸乙酯、乙醇渗漉提取，尽可能的得到最大提取得率，起到了较好的分离效果。体外抗肿瘤实验筛选出白藤梨根抗肿瘤的有效作用部位为乙酸乙酯提取物，明确了白藤梨根抗肿瘤的物质基础所在部位，结合指纹图谱等信息分析乙酸乙酯中的活性物质为三萜类化合物。本专利技术步骤操作简单方便，适用于白藤梨根有效成分的提取，总三萜提取得率比较高，适用于药材的大规模提取，有利于工业化的推广。附图说明图1是RTCADP实时细胞分析系统检测石油醚提取物对A549细胞活性的影响图。图2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法，其特征在于该白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法包括以下步骤：⑴预处理：取一定量的白藤梨根药材，烘干后高速粉碎机粉碎，过药筛得到颗粒均匀的白藤梨根粉末；⑵制备石油醚提取物：称取适量白藤梨根粉末，量取一定体积的石油醚浸泡白藤梨根粉末，超声提取后将白藤梨根药渣与提取液分离，提取液用滤纸过滤后，用旋转蒸发仪减压浓缩，得到石油醚提取物；⑶制备乙酸乙酯提取物：将步骤⑵中超声提取后的白藤梨根药渣在烘箱中烘干，挥干残余的溶剂，烘干后的药渣置于一定体积的乙酸乙酯中浸泡，浸泡后的白藤梨根药渣用乙酸乙酯为溶剂采用渗漉法提取，药渣待用，渗漉液用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物；⑷制备乙醇提取物：将步骤⑶中渗漉提取后的白藤梨根药渣经烘箱烘干溶剂，加入一定体积的乙醇浸泡，浸泡后的白藤梨根药渣用乙醇为溶剂采用渗漉法提取，渗漉液用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到乙醇提取物；⑸活性评价：采用RTCA DP实时细胞分析系统进行体外抗肿瘤实验，检测以上三种提取物对肿瘤细胞活性的影响，根据实验结果筛选出抗肿瘤效果最佳的提取物。

【技术特征摘要】
1.一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法，其特征在于该白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法包括以下步骤：⑴预处理：取一定量的白藤梨根药材，烘干后高速粉碎机粉碎，过药筛得到颗粒均匀的白藤梨根粉末；⑵制备石油醚提取物：称取适量白藤梨根粉末，量取一定体积的石油醚浸泡白藤梨根粉末，超声提取后将白藤梨根药渣与提取液分离，提取液用滤纸过滤后，用旋转蒸发仪减压浓缩，得到石油醚提取物；⑶制备乙酸乙酯提取物：将步骤⑵中超声提取后的白藤梨根药渣在烘箱中烘干，挥干残余的溶剂，烘干后的药渣置于一定体积的乙酸乙酯中浸泡，浸泡后的白藤梨根药渣用乙酸乙酯为溶剂采用渗漉法提取，药渣待用，渗漉液用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物；⑷制备乙醇提取物：将步骤⑶中渗漉提取后的白藤梨根药渣经烘箱烘干溶剂，加入一定体积的乙醇浸泡，浸泡后的白藤梨根药渣用乙醇为溶剂采用渗漉法提取，渗漉液用滤纸过滤后在旋转蒸发仪中减压浓缩，得到乙醇提取物；⑸活性评价：采用RTCADP实时细胞分析系统进行体外抗肿瘤实验，检测以上三种提取物对肿瘤细胞活性的影响，根据实验结果筛选出抗肿瘤效果最佳的提取物。2.根据权利要求1所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法，其特征在于所述的三种提取物中乙酸乙酯提取物中所含抗肿瘤活性物质含量最高，对肿瘤细胞抑制作用明显，乙酸乙酯提取物对人肝癌HepG2细胞有显著抑制作用，IC50为7.6μg/mL；对人肺癌A549细胞有抑制作用，IC50为150μg/mL。3.根据权利要求1或2所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法，其特征在于所述抗肿瘤效果最佳的提取物是乙酸乙酯提取物，其中的活性成分为三萜类化合物。4.根据权利要求1所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法，其特征在于所述步骤⑸中选用的肿瘤细胞为人肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞中的至少一种。5.根据权利要求1所述的一种白藤梨根抗肿瘤活性物质的筛选方法，其特征在于所述步骤⑸的具体操作为：取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个...

【专利技术属性】
技术研发人员：张家敏，张骋，
申请(专利权)人：张家敏，张骋，金华市人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33